長鏈非編碼RNA H19在多發性骨髓瘤硼替佐米耐藥中的作用研究*

肖 平 蔡桂程 陳文婷

(1. 海口市第三人民醫院骨科，?？?571100)(2. 海南省人民醫院血液內科，海口 570311)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞異?？寺⌒栽鲋车难合到y惡性腫瘤，大量異常單克隆免疫球蛋白的產生導致了靶器官功能損害[1]。雖然近年來，蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物、自體干細胞移植對MM的緩解率和整體存活率起到了顯著的提高作用，但是復發或腫瘤細胞的耐藥使得MM仍屬于難以治愈的惡性血液腫瘤[2]。硼替佐米(bortezomib)商品名萬珂(velcade)，是一種可逆的蛋白酶體抑制劑，是目前MM一線治療藥物[3]，但是后期獲得性的耐藥使得硼替佐米僅僅是延遲疾病進展時間，對患者的整體存活率無顯著影響。硼替佐米耐藥機制極其復雜，目前仍未完全闡明[4]，長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼轉錄片段，其在基因轉錄中的作用逐漸受到關注，其在腫瘤發病機制研究中的研究成為目前研究的熱點之一[5]，長鏈非編碼RNAH19(lncRNAH19)在胚胎中高表達，出生后表達下調，Zhu等[6]研究顯示lncRNAH19在多種惡性腫瘤中表達上調。本研究探討了lncRNAH19在多發性骨髓瘤硼替佐米耐藥中的作用。

1 臨床資料和方法

1.1 臨床病例資料

選取我院2017年2月—2018年12月治療的初診MM患者26例、硼替佐米化療緩解MM患者25例及硼替佐米化療后耐藥復發MM患者22例。納入對象：參照2017年修訂的中國多發性骨髓瘤診治指南診斷的MM患者[7]。排除對象：曾使用過免疫調節劑、自體干細胞移植或者其他生物治療者，伴發其他惡性腫瘤者。另取我院健康體檢者30例作為健康對照。對照組：男18例和女12例，年齡36～74歲，平均(58.24±11.34)歲；初診MM組：男15例和女11例，年齡35～73歲，平均(58.21±11.27)歲；緩解MM組：男14例和女11例，年齡35～75歲，平均(58.28±11.38)歲；耐藥MM組：男12例和女10例，年齡33～75歲，平均(58.19±11.24)歲，4組在性別及年齡方面均具有可比性，但差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 實驗試劑和儀器

人多發性骨髓瘤細胞系OPM2購自國家細胞資源庫；硼替佐米購自正大天晴藥業集團有限公司；RPMI1640 培養基、胎牛血清購自Gibco；細胞總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光染料試劑盒、Lipofectamine 2000 轉染試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自TaKaRa；lncRNAH19和內參β-actin擴增引物為上海吉凱制藥技術有限公司設計與合成；siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNA H19慢病毒載體以及空慢病毒載體由上海吉凱制藥技術有限公司構建和提供，序列見表1所列；7000熒光定量Real-time PCR儀購自ABI；Med550酶標儀購自Bio-Rad。

表1 引物序列表

1.3 lncRNA H19表達的熒光定量Real-time PCR檢測

抽取所有受試者靜脈血2 mL，使用細胞總RNA試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄處cDNA第一鏈，每例樣品取10 μg cDNA，加入lncRNAH19擴增引物和內參引物，使用熒光定量PCR試劑盒進行擴展，檢測各樣品熒光的變化，擴增條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，共反應40個循環。對照內參用2-△△Ct表示目的基因的表達水平。

1.4 慢病毒或干擾RNA轉染OPM2細胞以及CCK-8細胞活力檢測

人多發性骨髓瘤OPM2細胞于37 ℃、5% CO2條件下，培養于胎牛血清配制的RPMI1640 培養基，取對數生長期細胞接種24 孔板，每孔105個細胞，使用Lipofectamine 2000 轉染試劑盒，轉染siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNAH19慢病毒載體以及空慢病毒載體(MOI=100)，設立對照，37 ℃、5%CO2條件下轉染72 h，熒光下觀察細胞轉染率，PCR基因擴增鑒定轉染效果，轉染siRNA-H19的OPM2細胞標記為OPM2/si-H19，轉染siRNA-NC的OPM2細胞標記為OPM2/NC，轉染lncRNAH19慢病毒的OPM2細胞標記為OPM2/H19、轉染空病毒載體的OPM2細胞標記為OPM2/Blank。

取對數生長期對照OPM2細胞、OPM2/si-H19細胞、OPM2/NC細胞、OPM2/H19細胞和OPM2/Blank細胞接種到96 孔板，每孔104個細胞，適應性培養12 h后，加入對半系列稀釋的硼替佐米(0、3.125 nmol/L、6.25 nmol/L、12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L)繼續培養48 h后，按照CCK-8細胞活力檢測試劑盒說明書操作，加入CCK-8液，混勻，3 h后，酶標儀450 nm波長處測定各孔顏色的變化，參照對照計算IC50值。

1.5 統計學分析

資料輸入SPSS 16.0軟件進行分析，所有實驗至少重復三次，計量資料采用t檢驗，多組均數比較使用方差分析，計數資料使用X2分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MM患者中lncRNA H19表達的變化

由表2可知，對照組、初診MM組、緩解MM組和耐藥MM組lncRNAH19的2-△△Ct值分別為(0.107±0.032)、(0.324±0.067)、(0.218±0.042)和(0.486±0.095)，各組間具有顯著性差異(P<0.01)。其中，初診MM組顯著高于對照組和緩解MM組(P<0.01)，耐藥MM組又顯著高于初診MM組(P<0.01)。

表2 lncRNA H19表達的熒光定量PCR檢測

2.2 過表達或低表達lncRNA H19影響了硼替佐米對人多發性骨髓瘤OPM2細胞的敏感性

轉染后熒光顯微鏡下觀察對照組無熒光，OPM2/si-H19、OPM2/NC、OPM2/H19和OPM2/Blank組細胞陽性轉染率在90%以上，如圖1所示。經PCR基因擴增后確認OPM2/si-H19組lncRNAH19表達顯著減低、OPM2/H19組lncRNAH19表達顯著增加，OPM2/NC和OPM2/Blank組lncRNAH19表達無顯著性變化(圖2)。

圖1 lncRNA H19基因轉染效率的熒光檢測

圖2 lncRNA H19表達的PCR檢測

CCK-8細胞活力實驗結果顯示，對照組、OPM2/si-H19組、OPM2/NC組、OPM2/H19組和OPM2/Blank組細胞的IC50值分別為(17.86±1.64)nmol/L、(6.83±1.05)nmol/L、(18.04±1.72)nmol/L、(31.14±3.57)nmol/L和(17.75±1.68)nmol/L。其中，對照組、OPM2/NC組和OPM2/Blank組無顯著性差異(P>0.05)，OPM2/si-H19組硼替佐米IC50值顯著低于對照組(P<0.01)，OPM2/H19組硼替佐米IC50值顯著高于對照組(P<0.01)(圖3)。

圖3 各組OPM2細胞的CCK-8細胞活力實驗

3 討論

MM仍然是一種無法治愈的疾病，其復發率高，耐藥速度快是目前臨床治療的主要障礙[8]，因此探索其耐藥機制既有利于對MM 疾病本質的認識，也可以為疾病的治療提供新的靶點[9]。

lncRNA不編碼蛋白質，但其可以參與基因組的表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控。陳林等[10]研究顯示細胞外泌體中含量豐富，在腫瘤細胞中可以通過外泌體進行細胞間的傳遞。Shima等[11]研究顯示lncRNAH19在癌癥發生發展中發揮著作用。郭靜等[12]研究顯示高表達lncRNAH19的肝癌細胞以外泌體方式，通過激活蛋白磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，m TOR)(PI3K/AKT/m TOR)通路，增強其相鄰肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，可以促進肝癌的發生、發展。于潔等[13]在宮頸癌的研究中發現lncRNAH19可以調控 Bcl-2表達影響宮頸癌細胞的生物學行為，裸鼠移植瘤實驗顯示抑制lncRNAH19表達后宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力也會得到顯著抑制。本研究檢測顯示MM組lncRNAH19的2-△△Ct值顯著高于對照組，說明了MM患者高表達lncRNAH19，提示了lncRNAH19可能也參與了MM的發生過程，進一步的分析顯示耐藥MM組lncRNAH19的2-△△Ct值顯著高于初診MM組，而緩解MM組lncRNAH19的2-△△Ct值出現了顯著的減低，提示了高表達lncRNAH19可能參與了硼替佐米的耐藥。

硼替佐米是目前治療MM最有效的化療藥物，但獲得性的耐藥常常阻礙了硼替佐米長期療效的發揮[14]，長鏈非編碼RNA在表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等多層面調控基因表達[15]，在惡性腫瘤的發生、發展、耐藥等過程存在很多潛在作用[16]。徐鵬翔等[17]在替莫唑胺抵抗的腦膠質瘤中發現lncRNAH19可以通過上調6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)mRNA的表達維持替腦膠質瘤對莫唑胺的抗性。Shima等[11]在乳腺癌的研究中發現，lncRNAH19可以上調醛脫氫酶1(ALDH1)表達，維持腫瘤干細胞的表型，而腫瘤干細胞正是腫瘤耐藥的根源之一。本研究探討了lncRNAH19在MM患者硼替佐米耐藥中的作用，使用siRNA干擾OPM2細胞lncRNAH19后，硼替佐米對OPM2細胞的IC50值顯著減低，使用慢病毒過表達lncRNAH19后，硼替佐米對OPM2細胞的IC50值顯著升高，說明了lncRNAH19低表達可以顯著增加硼替佐米對OPM2細胞的敏感性，lncRNAH19高表達可以顯著降低硼替佐米對OPM2細胞的敏感性，上述結果提示了lncRNAH19高表達可能參與了MM的硼替佐米耐藥，但其具體的作用機制本文未做深入探討，為本研究的不足之處。

綜上所述，本研究觀察到MM患者lncRNAH19顯著升高，尤以硼替佐米耐藥MM患者為甚，高表達lncRNAH19可能參與了硼替佐米耐藥過程，為硼替佐米耐藥的克服提供了一個新的治療靶點。