炎調方對膿毒癥大鼠腸道微生態環境的影響研究*

王 柳 李淑芳

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021）

膿毒癥是一種由感染引起的生理、病理和生化異常綜合征，發病率和病死率高［1］。國外一項基于7個高收入國家的膿毒癥流行病學調查估計，全球每年可有3 150萬例膿毒癥病例，并有530萬病例死亡［2］，平均每人花費3.2萬美元［3］。隨著膿毒癥與腸道菌群研究的深入，目前發現膿毒癥與腸道菌群之間存在密切關聯，為探索膿毒癥的發病機制與治療開辟了新的研究方向。前期臨床研究已證實炎調方可調控膿毒癥大鼠及患者的白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平，減輕炎癥反應，從而降低膿毒癥患者的病死率［4］。據此可以猜測，炎調方正是通過調節腸道菌群來減輕炎癥反應，達到治療膿毒癥的作用。本研究旨在探討炎調方對膿毒癥大鼠腸道微生態環境的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只SPF級SD大鼠，體質量（200±20）g，由上海西普爾-必凱有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2013-2016，實驗動物批號：1910150023。大鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，室溫22～24℃，相對濕度40%～60%。每5只裝1個鼠籠，自由飲水，進食普通標準飼料，每天7∶00～19∶00予以光照，適應性飼養1周后進行試驗。

1.2 實驗藥物

炎調方由生大黃9 g（后下），芒硝10 g（沖），桃仁10 g，玄參15 g，赤芍15 g，當歸15 g，金銀花15 g，連翹15 g，麥冬10 g組成。以上藥物購自曙光醫院，采用藥物免煎劑，將藥物加入等體積蒸餾水，使藥液濃縮成含生藥1.0 g/mL，置4℃冰箱保存備用。雙歧桿菌三聯活菌膠囊（培菲康，產自上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字 S10950032，含菌量 5.8×1010CFU/g），使用時將0.035 g粉劑倒入eppendorf管中，加入2 mL的等滲NaCl溶液混勻，含益生菌≥1×109CFU/mL。

1.3 試劑與儀器

DNA抽提試劑盒DNeasy? PowerSoil? Pro Kit購自QIAGEN公司。建庫試劑盒NEXTFLEX Rapid DNASeq Kit購自Bioo Scientific公司，測序試劑盒MiSeq Re?agent Kit購自Illumina公司，以上試劑盒均由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供。ELISA試劑盒（IL-8、IL-10和TNF-α）購自上海威奧有限公司。灌胃針、眼科剪、眼科鑷、血管鉗、手術縫針、手術縫線、穿刺針、凍存離心管、電子天平均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.4 分組與給藥

采用完全隨機設計，以SPSS25.0生成隨機數字，將40只SD大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、炎調方組、益生菌組、炎調方+益生菌組，每組8只。各組均常規飼養。假手術組、模型組以生理鹽水2 mL連續灌胃3 d，每天1次；參考《藥理實驗方法學》［5］，換算大鼠使用的炎調方劑量為9.8 g/（kg·d），炎調方組以炎調方（9.8 g/kg）灌胃3 d，每天1次；益生菌組以益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次；聯合組以炎調方（9.8 g/kg）和益生菌灌胃（LGG 1×109CFU/mL）灌胃3 d，每天1次。

1.5 模型制備［6］

各組均于第3次灌胃2 h后造模。大鼠經2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后剃去腹部被毛，75%酒精消毒腹部皮膚，沿腹中線位置剪開1～2 cm，分離表皮和肌層，找到盲腸，小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。在盲腸長度1/2或3/4的位置用3號線結扎，結扎后使用8號針頭來回貫穿兩次，從針孔擠出少量腸內容物，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內容物黏附在手術切口，逐層縫合肌肉層和皮膚。術后予生理鹽水（30 mL/kg）皮下注射預防休克。假手術組麻醉后開腹翻動盲腸，隨即關腹。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 糞便標本采集與16Sr DNA測序 單手捏住頸后皮毛將其提起，另一只手固定尾部（灌胃和腹腔注射樣姿勢），待大鼠自然排便后收集于5 mL Ep管中，-80℃保存，干冰寄送。基于Illumina Miseq PE300平臺進行16Sr DNA測序。糞便標本經研磨、震蕩、離心、洗脫得到總DNA。完成DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。利用338F_806R引物（F端序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，R端序列：GG ACTACHVGGGTWTCTAAT）對V3～V4可變區進行PCR擴增。將純化后的PCR產物進行定量與均一化，構建Miseq文庫，最后借助Illumina Miseq PE300平臺進行16Sr DNA測序。Miseq測序得到的原始序列首先根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣本后按照97%的相似度進行OTU聚類，得到原始OTU表。測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.6.2 血清標本采集與炎癥因子（IL-8、IL-10和TNF-α）檢測 2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，固定于固定架，剪去腹正中毛發，安爾碘消毒皮膚，置于超凈臺，鋪巾。用無菌手術器械沿腹正中線逐層剪開，拉出腸等腔內器官，打開后腹膜層，暴露腹主動脈，以5 mL無菌注射器緩慢抽血，裝入非抗凝無菌管中，以3 000 r/min離心15 min，取上清，分裝，-80℃保存。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清IL-8、IL-10和TNF-α，參照試劑盒說明書上操作方法進行檢測。

1.7 統計學處理

以SPSS25.0及美吉生物云平臺進行數據處理。計量資料以（±s）差表示，符合正態分布且方差齊性的采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗；不符合正態分布且方差不齊的采用秩和檢驗。計數資料以率或百分比表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組炎癥因子水平比較

見表1。與假手術組比較，模型組IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，差異有統計學意義（P<0.01）。炎調方組、益生菌組和聯合組TNF-α水平高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05），IL-10水平低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，炎調方組、益生菌組和聯合組IL-8水平、TNF-α水平均較模型組降低，IL-10水平均較模型組升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與炎調方組比較，IL-10水平益生菌組降低，聯合組升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；TNF-α水平益生菌組、聯合組均升高，差異有統計學意義（P<0.01）。

表1 各組炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

注：與假手術組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與炎調方組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同。

組別假手術組模型組炎調方組益生菌組聯合組n 8 8 8 8 8 IL-8 27.38±18.38**55.01±10.23▲▲29.06±4.60**28.89±3.15**37.19±9.17**IL-10 46.16±6.44**##17.26±3.76##▲▲30.59±4.76**▲▲24.37±2.52**##▲▲38.79±2.88**##▲▲TNF-α 163.43±31.58**#513.69±41.35##▲▲225.46±37.89**▲262.67±49.82**▲▲392.10±103.55**##▲▲

2.2 各組測序數據統計

對5組CLP膿毒癥大鼠共40個樣本進行測序，得到有效序列數為1 921 430，有效堿基數為811 500 698 bp，平均序列長度為422.34。按最小樣本序列數對原始OTU表進行抽平后用于后續分析。隨著測序數量的增加，泛物種逐漸增加，核心物種逐漸減少，兩者曲線趨于平緩，根據Pan/Core曲線評估顯示樣本量充足，見圖1。

圖1 樣本測序曲線

2.3 各組腸道菌群α多樣性指數分析

見表2。與假手術組比較，模型組simpson指數升高（P<0.01）。與模型組比較，炎調方組sobs指數升高（P<0.05），shannon指數升高（P<0.01），simpson指數降低（P<0.05）。與炎調方組比較，益生菌組shannon指數降低（P<0.01），simpson指數升高（P<0.01）；聯合組sobs指數和shannon指數均降低（P<0.01或P<0.05），simpson指數升高（P<0.05）。

表2 各組腸道菌群α多樣性指數分析比較（±s）

表2 各組腸道菌群α多樣性指數分析比較（±s）

images/BZ_43_1248_577_2252_643.png 假手術組模型組炎調方組益生菌組聯合組88888 213.30±29.70 227.10±38.30#262.60±20.70▲▲*239.30±25.40 240.50±17.30▲#3.10±0.30 2.90±0.40##3.50±0.10▲▲**3.20±0.20##3.20±0.20##0.10±0.03 0.13±0.08▲▲#0.06±0.01▲▲*0.09±0.02##0.09±0.03#

2.4 各組腸道菌群LEfSe多級物種差異判別分析

在α多樣性指數基礎上，進一步進行腸道菌群結構分析，即采用線性判別分析（LDA）估算物種豐度對多樣性指數組間差異的影響大小，LDA閾值為2，結果見表3，圖2～圖4。1）在模型組中，理巖菌科（Rikenel?laceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）存在高豐度，差異有統計學意義（P<0.05）；疣微菌門（Verrucomicrobiota）豐度相較于其他各組大大減低，差異有統計學意義（P<0.05）。2）益生菌 組雙歧桿菌（Bifidobacteriaceae）存在高豐度（LDA值=2.50，P<0.001）。3）炎調方組疣微菌門存在高豐度，均高于其他各組（LDA值=4.11，P<0.05）。

表3 各組腸道菌群LEfSe多級物種差異判別分析

圖2 各組理巖菌科、黃桿菌科豐度比較

圖3 各組葡萄球菌科、雙歧桿菌科豐度比較

圖4 各組疣微菌門豐度比較

3 討論

腸道被認為是膿毒癥和多臟器功能障礙的“始動器官”和關鍵的促炎器官［1］，腸道微生態失調是導致膿毒癥免疫炎癥失衡以及多臟器功能障礙的核心。膿毒癥時，細胞旁通透性增加［7-8］，從而增加腸黏膜的通透性。此外，膿毒癥患者的腸上皮細胞凋亡顯著上升，進一步降低了腸屏障功能，并因此導致腸道菌群易位。Robert P.Dickson等的實驗表明肺菌群中腸道細菌的富集與急性全身性炎癥的嚴重程度相關［9］。目前已有實驗證明腸道菌群與膿毒癥免疫炎癥反應有密切關系［10-12］。因此，逆轉膿毒癥時的腸道菌群失衡可能是改善膿毒癥全身炎癥反應的突破口。

實驗研究發現，大鼠、小鼠的腸道菌群主要為擬桿菌門、厚壁菌門，其次為變形菌門、放線菌門和疣微菌門等，與人體相似［13］。目前針對膿毒癥腸道菌群的調控，僅限于益生菌、益生元和糞便菌群移植（FMT）的應用等，但是FMT技術并不成熟。因此，調節腸道菌群藥物和方法的局限性為探究中醫藥干預腸道菌群提供了更大的空間。

膿毒癥屬于中醫學“熱病”范疇，發病關鍵為熱、毒、瘀。本課題組總結膿毒癥的病機為熱毒積聚，毒陷入腑，致腑實營熱，治療上當以通腑、清熱、活血為要［14］。炎調方全方一通腑氣，暢達氣機；二解熱毒，拔本塞源；三護陰津，陰陽和合。由于炎調方的目標作用器官在腸腑，且前期臨床試驗已證實炎調方可降低IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平以減輕膿毒癥患者和膿毒癥大鼠的炎癥反應［4，15］。故此，本實驗以腸道菌群為切入點，通過益生菌、炎調方等不同的干預方式，探究炎調方對腸道菌群的調控作用是否是其治療膿毒癥的潛在機制。

本研究結果顯示，模型組較假手術組IL-8、TNF-α水平升高，IL-10水平下降，說明CLP造模成功。炎調方與益生菌聯合應用對于調控IL-10水平效果比單用炎調方效果顯著，而在調控TNF-α水平方面，炎調方優于益生菌組和炎調方+益生菌組。炎調方的干預成功減輕了膿毒癥大鼠過度的炎癥反應。在α多樣性分析中，以sobs指數反映群落豐富度，其與群落豐富度呈正相關；以shannon指數、simpson指數反映群落多樣性，shannon指數與群落多樣性呈正相關；simpson指數與群落多樣性呈負相關。膿毒癥大鼠腸道菌群結構發生了變化，模型組shannon指數較假手術組減低，simp?son指數升高，反映了膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性降低。炎調方、益生菌、炎調方和益生菌聯合干預均可以提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性，炎調方組優于兩外兩組。本實驗中并未發現在提高腸道菌群多樣性方面，益生菌與炎調方二者之間存在協同性。

在α多樣性指數分析基礎上，我們進一步采用LDA分析篩選對組間差異影響較大的物種。結果發現，模型組中存在高豐度且具有統計學意義的菌群為黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、理巖菌科（Rikenellace?ae）和葡萄球菌科（Staphylococcaceae）。現有研究發現，黃桿菌科可能是替加環素抗性基因tet（X）的潛在祖先來源［16］，布洛芬等非甾體抗炎藥物的使用可以增加理巖菌科的細菌數量［17］，金黃色葡萄球菌是常見的致病菌，可引起皮膚和軟組織感染、手術部位感染、肺炎和敗血癥等多種疾病［18-19］。而益生菌組雙歧桿菌的高豐度極可能由培菲康干預導致。另外，疣微菌門作為炎調方組區別與其他各組的菌種，其與炎調方作用機制可能存在潛在關聯，需今后進一步探索研究。本實驗的優勢在于通過炎調方與益生菌干預的對照，明確了炎調方在減輕過度的炎癥反應和提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性方面的優勢，并且排除了臨床上抗生素應用、喂養方式以及大便標本采集時間和不同感染部位等多因素對腸道菌群的干擾。但是本實驗采用統一的創傷性造模方式，與臨床上非創傷性感染引起的膿毒癥存在差異。在腸道菌群豐度和多樣性方面，炎調方組、益生菌組和炎調方+益生菌組均高于假手術組這一現象需進一步實驗驗證。

綜合以上分析，炎調方在調控膿毒癥大鼠炎癥因子水平，減輕過度的炎癥反應的同時，可以提高膿毒癥大鼠腸道菌群多樣性和豐富度。其減輕炎癥反應與調節腸道菌群之間的關聯機制有待進一步研究。