上感顆粒調(diào)節(jié)肺炎鏈球菌感染性肺炎小鼠炎癥反應的研究*

李津金 王毅軍 芮慶林 王海丹 指導 奚肇慶

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

社區(qū)獲得性肺炎是醫(yī)院外獲得的，由于病原微生物侵入患者肺實質(zhì)導致的急性炎癥，臨床上一般會出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咯痰等癥狀。肺炎鏈球菌感染性肺炎是社區(qū)獲得性肺炎中最常見的一種。江蘇省名中醫(yī)奚肇慶教授基于長期肺系疾病臨證經(jīng)驗分析認為：社區(qū)獲得性肺炎患者大多是由于正氣虛虧，表衛(wèi)不固，不足以抵御外邪，導致外邪入里化熱所致。奚肇慶在溫熱外感發(fā)熱的理論和辨證方藥的基礎上，研制出江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)特色制劑上感顆粒，上感顆粒具有于衛(wèi)分疏解溫熱之邪的功效。目前，上感顆粒在本院已經(jīng)常規(guī)用于治療上呼吸道感染，并取得了滿意的臨床療效［1-4］。根據(jù)上述理論，本課題組將上感顆粒用于治療肺炎鏈球菌肺炎小鼠，也取得了令人滿意的實驗療效［5］。本實驗在前期研究基礎上，進一步研究了上感顆粒治療肺炎鏈球菌肺炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)機制，為上感顆粒治療肺炎鏈球菌感染性肺炎提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級BALB/c小鼠120只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，雌雄各60只。由揚州大學醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2012-0004。

1.2 試藥及儀器 上感顆粒由柴胡（批號：1504018）、黃芩（批號：1501086）、羌活（批號：1502032）、薄荷（批號：1412140）、青蒿（批號：1444097）、生石膏（批號：1407047）、大青葉（批號：1412058）、鴨跖草（批號：1408176）、生甘草（批號：1505106）按比例組成配方，由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。鹽酸左氧氟沙星片，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供（批號：14111153）。白細胞介素-2（IL-2）試劑盒（批號：20150706MT）、SIL-2R試劑盒（批號：20150706MU）、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號：20150706BH）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號：20150712MU），由上海朗頓生物科技有限公司提供。臨床分離的肺炎鏈球菌，由江蘇省中醫(yī)院檢驗科微生物室提供。超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；FA1004電子天平（上海天平廠）；YXQ-2S-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；生物安全柜BSC-1500ⅡA2-X（濟南鑫貝西亞生物技術(shù)有限公司）；孵箱（上海分析儀器廠）；SUNRISE酶標儀（瑞士TECAN公司）；AU480全自動生化儀（美國BECKMAN公司）；FACSCanto流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 分組與造模 取BALB/c小鼠隨機分成6組，每組20只，分別為正常組、模型組、上感顆粒小劑量組、上感顆粒大劑量組、左氧氟沙星組、上感顆粒大劑量聯(lián)合左氧氟沙星組（聯(lián)合組）。按照文獻［6］的方法建立肺炎鏈球菌肺炎小鼠模型。給藥前1 d，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，待小鼠進入麻醉狀態(tài)后，使用1 mL醫(yī)用無菌注射器針頭刺破小鼠鼻黏膜，滴入預先制備的肺炎鏈球菌菌液50 μL，含菌量3×107CFU［6］。

1.4 給藥方法 造模后第2天開始給藥，模型組、正常組予等量生理鹽水，上感顆粒小、大劑量組分別按28.2、56.4 g/kg給藥，左氧氟沙星組按0.249 g/kg給藥，聯(lián)合組予上感顆粒56.4 g/kg+鹽酸左氧氟沙星0.249 g/kg。各組給藥體積均為0.2 mL/10 g，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d。

1.5 標本采集與檢測 1）CD4+、CD8+T細胞：在給藥后第3天末、第6天末，各組小鼠眼眶靜脈叢取血0.5～1 mL，采血后將血液垂直顛倒混勻，用流式細胞儀進行檢測。2）血清IL-2、可溶性白細胞介素-2受體（SIL-2R）、IL-6、TNF-α水平：在給藥后第3天末、第6天末，各組小鼠眼眶靜脈叢取血0.1 mL，離心取血清，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+ T細胞水平比較 見表1。給藥第3天末，模型組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞、CD4+/CD8+水平與正常組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒小劑量組、大劑量組、聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組、聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞與左氧氟沙星組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組小鼠外周血中CD4+T細胞與小劑量組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+T細胞與上感顆粒小劑量組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞水平比較（±s）

表1 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與左氧氟沙星組比較，■P<0.05；與上感顆粒小劑量組比較，●P<0.05。下同。

組別正常組（n=20）模型組（n=20）左氧氟沙星組（n=20）上感顆粒大劑量組（n=20）上感顆粒小劑量組（n=20）聯(lián)合組（n=20）時間第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天CD4+T 23.65±3.05*22.15±3.21**56.27±5.71 63.21±4.82 50.71±4.15*43.27±3.39**43.81±3.89*■●31.36±3.46**■●48.39±2.78*39.72±2.83**44.53±3.16*■●31.02±3.87**■●CD8+T 35.56±2.51*36.13±2.72**58.23±4.92 69.52±3.87 49.65±3.27*39.52±4.63**45.92±2.96*■34.29±3.01**■44.32±2.78*6.56±3.76**46.12±2.35*■33.93±2.87**■CD4+/CD8+0.66**0.61**0.96 0.91 1.02 1.09*0.95 0.91 1.09*1.08*0.97 0.91

給藥第6天末，模型組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞、CD4+/CD8+水平與正常組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；上感顆粒小劑量組、大劑量組、聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；上感顆粒大劑量組、聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+、CD8+T細胞與左氧氟沙星組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組小鼠外周血中CD4+T細胞與小劑量組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；聯(lián)合組小鼠外周血中CD4+T細胞與上感顆粒小劑量組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 各組小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比較 見表2。給藥第3天末，模型組小鼠血清SIL-2R、IL-6水平與正常組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組、小劑量組、聯(lián)合組小鼠血清IL-2水平與模型組比較，均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；上感顆粒大劑量組、小劑量組、聯(lián)合組小鼠血清SIL-2R水平與模型組比較，均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組、小劑量組小鼠血清IL-6水平與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；上感顆粒大劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α水平與左氧氟沙星組比較，均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組小鼠血清TNF-α水平與小劑量組比較，明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠血清IL-2、SIL-2R、IL-6、TNF-α水平比較（ng/L，±s）

images/BZ_59_165_2477_1169_2543.png正常組（n=20）模型組（n=20）左氧氟沙星組（n=20）上感顆粒大劑量組（n=20）上感顆粒小劑量組（n=20）聯(lián)合組（n=20）第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天第3天第6天43.43±13.05 54.11±6.79*46.21±11.71 45.76±5.17 60.74±6.15*62.55±13.46*66.81±6.85**56.71±9.89*■●68.39±9.48**40.88±13.59■65.50±11.13*62.64±6.86**★5.31±2.01*5.87±1.72 6.23±1.92 4.23±1.31 5.65±1.23*3.35±2.03*4.91±2.56*3.51±1.96*5.12±1.78*4.12±1.98 5.11±1.85*3.29±1.57*★240.0±19.08*202.7±15.13**271.2±28.50 247.7±12.96 247.5±12.89 241.9±21.39 212.4±21.98**■205.0±18.13**■233.4±19.66*197.9±37.13*■258.7±26.77 217.3±34.44■●214.6±20.99 219.9±4.79**221.1±15.39 257.0±23.60 229.9±15.81 194.0±28.16**200.6±29.28■●186.2±15.64**235.0±53.59 198.4±29.97**240.7±36.2 215.2±17.07**

給藥第6天末，模型組小鼠血清IL-2水平與正常組比較，明顯降低，血清IL-6、TNF-α水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05）；上感顆粒大劑量組、聯(lián)合組小鼠血清IL-2水平與模型組比較，均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；上感顆粒大劑量組、小劑量組小鼠血清IL-2水平與左氧氟沙星組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組小鼠血清IL-2水平與小劑量組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；聯(lián)合組小鼠血清IL-2水平與上感顆粒小劑量組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組、聯(lián)合組小鼠血清SIL-2R水平與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；聯(lián)合組小鼠血清SIL-2R水平與上感顆粒小劑量組比較，明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒小劑量組、大劑量組小鼠血清IL-6水平與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）；上感顆粒大劑量組、小劑量組、聯(lián)合組小鼠血清IL-6水平與左氧氟沙星組比較，均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；聯(lián)合組小鼠血清IL-6水平與上感顆粒小劑量組比較，明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；上感顆粒大劑量組、小劑量組、聯(lián)合組小鼠血清TNF-α水平與模型組比較，均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

3 討論

機體受細菌毒素、損傷打擊后，首先會出現(xiàn)一過性細胞免疫功能降低，使機體對感染易感；其次，機體受到刺激后，體內(nèi)免疫細胞會被激活，不但會釋放大量的促炎介質(zhì)，引起全身炎癥反應綜合征，同時也會釋放一定量的內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，抑制炎癥反應，形成代償性抗炎反應綜合征；如果機體的炎癥反應和抗炎反應保持相對平衡，則機體內(nèi)環(huán)境就能夠維持在相對穩(wěn)定狀態(tài)，組織、器官功能不會收到明顯損傷。一旦全身炎癥反應綜合征和代償性抗炎反應綜合征失衡，將會引起機體內(nèi)環(huán)境紊亂，導致機體組織器官損傷，嚴重者甚至發(fā)生多臟器功能衰竭。常見的促炎介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素（IL-1、IL-6、IL-8）等，主要介導機體炎癥反應，導致組織、器官損傷；常見的抗炎介質(zhì)，包括IL-2、IL-4、IL-10等，主要抑制促炎介質(zhì)釋放，防止過激的炎癥反應［7-13］。因此在機體受細菌毒素、損傷打擊后，如果能夠抑制免疫細胞過度激活，使促炎介質(zhì)釋放減少，抗炎介質(zhì)釋放增加，則能夠減少失控的炎癥反應對機體造成的損傷。

上感顆粒組分為柴胡、黃芩、羌活、薄荷、青蒿、石膏、大青葉、鴨跖草、生甘草。其中柴胡和黃芩共為君藥，柴胡輕清升散，疏邪透表；黃芩苦寒，善清表里之火，一散一清，清解邪熱。羌活、薄荷、青蒿、石膏同為臣藥，羌活、薄荷合柴胡加強疏邪解表之力，且可避免全方過于寒涼，兼能除濕，為治肢體酸痛之要藥；青蒿清熱瀉火，助黃芩清表里郁熱；石膏除煩解肌，泄熱。大青葉、鴨跖草則為佐藥，共輔黃芩清熱解毒，瀉火。甘草為使，扶正以助祛邪。上感顆粒組方嚴謹、靈活，君臣佐使諸藥各司其職，使溫熱之邪疏解于衛(wèi)分。動物實驗表明上感顆粒治療病毒性肺炎小鼠，主要通過免疫調(diào)節(jié)機制發(fā)揮治療作用。相關研究顯示，上感顆粒能夠抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群增殖，導致CD4+/CD8+水平降低，同時抑制TNF-α等炎性介質(zhì)釋放，促進IL-2等抗炎介質(zhì)釋放，維持機體相對的免疫穩(wěn)態(tài)，從而能夠減輕過激的炎癥反應對組織造成損傷，發(fā)揮出良好的治療作用［14-16］。

本研究結(jié)果顯示，上感顆粒對肺炎鏈球菌肺炎小鼠良好的治療效果，可能是通過免疫調(diào)節(jié)機制發(fā)揮的。在肺炎鏈球菌感染的第3天和第6天末，模型組的CD4+、CD8+T細胞、CD4+/CD8+水平與正常組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），提示體內(nèi)免疫細胞被激活；模型組的促炎介質(zhì)血清IL-6、TNF-α水平與正常組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示免疫細胞被激活后，進一步導致促炎介質(zhì)大量釋放。上感顆粒小劑量組、大劑量組、大劑量聯(lián)合左氧氟沙星組的CD4+、CD8+T細胞與模型組比較，則有不同程度下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示上感顆粒對體內(nèi)免疫細胞激活有一定的抑制調(diào)節(jié)作用；模型組的抗炎介質(zhì)血清IL-2水平與接受上感顆粒治療的小鼠比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示上感顆粒抑制體內(nèi)免疫細胞過度激活、減少促炎介質(zhì)釋放的同時，還能促進抗炎介質(zhì)分泌，從而防止過激的炎癥反應對肺組織的損傷。接受上感顆粒治療小鼠的血清SIL-2R與模型組比較，則有明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示上感顆粒可能還通過減少血清SIL-2R合成，進一步導致抗炎介質(zhì)血清IL-2升高。

在感染的第6天末，上感顆粒小劑量組、大劑量組、聯(lián)合組的促炎介質(zhì)血清IL-6、TNF-α水平與模型組比較，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而抗炎介質(zhì)血清IL-2水平與模型組比較，明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同樣提示接受上感顆粒治療的肺炎小鼠炎癥反應比模型組的強度低，造成的肺組織損傷較輕，這與我們前期研究發(fā)現(xiàn)一致［5］。

本研究表明上感顆粒對于肺炎鏈球菌肺炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用是其發(fā)揮療效的一個重要機制。上感顆粒可能通過抑制免疫細胞的過度激活，減少炎性介質(zhì)釋放、促進抗炎介質(zhì)釋放，維持機體炎癥反應和代償性抗炎反應之間的相對平衡，從而避免機體過激的炎癥反應造成組織、器官發(fā)生嚴重損傷。