細菌黏附及其影響因素的研究進展

劉 宇 鄭國俠 王云華

大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧省大連市 116000

細菌黏附普遍存在于自然界和日常生活中，是重要的生物學(xué)現(xiàn)象。細菌在宿主表面的黏附是細菌感染的關(guān)鍵步驟，單個細菌的黏附是生物膜形成的第一個步驟。細菌黏附引起的感染已被公認為是全球范圍內(nèi)最關(guān)鍵的健康挑戰(zhàn)之一，每年受影響的人數(shù)以百萬計[1]。了解細菌黏附的機制及其影響因素、檢測細菌在各種材料表面的黏附，將使得我們能夠根據(jù)需要來調(diào)節(jié)其黏附能力。本文從影響細菌黏附的因素及細菌黏附的研究模型進行綜述。

1 常見的細菌黏附

細菌黏附主要表現(xiàn)在醫(yī)學(xué)、食品安全和工業(yè)方面。在大多數(shù)場合，細菌黏附帶來的是負面的影響；但也有一些場合，細菌黏附是有利的。

在醫(yī)學(xué)方面，細菌黏附于宿主細胞，是跨越細胞和組織屏障的起點。建立對宿主細胞的穩(wěn)定黏附后，細菌能夠在宿主內(nèi)傳播并表達或進一步釋放毒力因子，從而感染宿主細胞。細菌黏附引起的手術(shù)感染是醫(yī)院最常見的感染之一，77%病例的死亡直接歸因于手術(shù)感染。例如，在使用醫(yī)療設(shè)備(如植入物)進行組織和器官功能重建時，醫(yī)療設(shè)備容易被細菌污染，之后黏附的細菌會導(dǎo)致成熟和復(fù)雜的三維生物膜結(jié)構(gòu)形成，感染周圍組織，并可能引起復(fù)雜的慢性感染。細菌主要通過界面作用黏附在各類留置醫(yī)療設(shè)備材料表面，例如導(dǎo)管、支架和牙科種植體，并經(jīng)常發(fā)生生物膜相關(guān)感染。此外，口腔是多種微生物共存的微環(huán)境，牙科種植體存在于這種環(huán)境中，易使細菌定植于其結(jié)構(gòu)表面，尤其是牙齦結(jié)構(gòu)基臺的表面，唾液沖刷及物理操作不易清潔，使得種植體周圍組織發(fā)生細菌感染率升高[2]。

在食品安全方面，細菌主要黏附于食物接觸表面，包括食物容器、器皿、切片機、盤子、水壺、切割木板、刀具、鋼托盤和鏟子、不銹鋼容器和塑料容器中，是食源性疾病暴發(fā)的主要原因之一。據(jù)報道，2018 年因國內(nèi)食品細菌黏附危害導(dǎo)致死亡人數(shù)達到上萬人，經(jīng)濟損失高達近 100億。

在工業(yè)方面，細菌容易在工業(yè)輸水管道內(nèi)壁、蓄水池、游泳池的池壁表面、廢水過濾分離膜和飲用水過濾器膜表面等附著和生長，細菌等微生物滋生會導(dǎo)致用水水質(zhì)變差、管道過濾膜堵塞和危及人類健康等重大危害。細菌黏附的影響有時也是有利的。例如，在利用細菌處理污水時，增加細菌在水處理設(shè)備上的黏附能力，將減少細菌的損傷量，延長細菌補充周期，降低生產(chǎn)成本。在利用固定床進行發(fā)酵生產(chǎn)生物制品時，增加細菌在固定床上的黏附，也有利于延長其使用周期。

2 細菌黏附的影響因素

細菌黏附是細菌與材料表面的相互作用過程。細菌本身的特性、材料特性和黏附環(huán)境等多個方面的因素均會對細菌的黏附過程產(chǎn)生重要影響。對這些影響因素及其作用機制的深入研究，將有助于抗菌材料和抗菌藥物的開發(fā)。

2.1 細菌因素 細菌本身的特性主要包括細菌含有的特定基因、表達的蛋白和分泌的黏性物質(zhì)。有些細菌可能表達與黏附相關(guān)的蛋白，其含量表達量通常與細菌黏附成正比。吳彥平等人通過比較沙門氏菌腸炎血清型鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)和沙門氏菌腸炎血清型鼠傷寒亞種(S. Typhi)PagN等位基因變體與不同腸細胞以及細胞外基質(zhì)層粘連蛋白的結(jié)合情況發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌PagN等位基因變體的結(jié)合較好、黏附較強。并且，取PagN等位基因中49和109處的氨基酸殘基進行取代分析顯示，殘基49處的谷氨酸增加了鼠傷寒沙門氏菌PagN的黏附[3]。另外，Horstmann等人利用甲基化酶使鼠傷寒沙門氏菌鞭毛的鞭毛蛋白中的賴氨酸甲基化，增強了沙門氏菌對鞭毛的依賴，促進了其與上皮細胞的黏附；Pilicides是抑制革蘭陰性菌中伴侶通路的化合物，該抑制劑靶向菌毛伴侶蛋白PapD，利用Pilicides可以將細菌對細胞株的黏附率降低90%，說明菌毛伴侶蛋白在細菌的黏附中發(fā)揮重要作用[4]。

同時，細菌可以通過細胞膜分泌的黏性物質(zhì)(如黏附素、表層蛋白)與材料結(jié)合而黏附在其表面。例如，在對數(shù)生長前期或穩(wěn)定期收獲的乳酸菌，其黏附性顯著下降，可能是因為在這兩個時期收獲的乳酸菌表達的黏附素較低，菌體活性較弱；Vaca等人發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌的表面黏附素——三聚體自動轉(zhuǎn)運蛋白(Acinetobacter trimeric autotransporter，Ata)表達降低時，黏附于細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ和Ln膠原蛋白)的細菌也顯著減少，進而證明了Ata是鮑曼不動桿菌與ECM結(jié)合的至關(guān)重要成分，從而突出了Ata在細菌黏附中的重要性。此外，去除表層蛋白(S層蛋白)后的乳酸菌菌體，其黏附性顯著下降。

2.2 黏附材料 從與細菌相互作用的黏附材料方面來說，影響?zhàn)じ阶饔玫闹饕蛩匕ú牧媳旧淼男再|(zhì)、其表面結(jié)構(gòu)及摻雜材料等。通過改進材料性能或結(jié)構(gòu)來抑制細菌的黏附，可以大幅度減少殺菌劑或消毒劑的使用，具有重要的實用價值，是目前研究的重要領(lǐng)域之一。

2.2.1 材料的親疏水與帶電性質(zhì):黏附材料本身的性質(zhì)，主要包括親疏水性能、帶電狀態(tài)等方面，對細菌的黏附有較大的影響。通常，細菌黏附與疏水性成反比。例如在玻璃上大腸桿菌黏附較多，而在聚四氟乙烯黏附較少，主要是聚四氟乙烯的疏水性較高。武鉞和金建烽等人利用氧化石墨烯通過電鍍法成功加載于純鈦表面，提高了純鈦表面的親水性能，有利于金黃色葡萄球菌的黏附。Camargo等人通過制備兩種涂層，即利用季銨化過程將氮化鈦(titanium nitride，TiN)和碳化硅(Silicon carbide，SiC)上的表面氮轉(zhuǎn)化為正電荷生產(chǎn)季銨化的氮化鈦(Quaternized titanium nitride，QTiN)和季銨化的碳化硅(Quaternized silicon carbide，QSiC)。通過掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)圖像證實，相比于TiN和SiC涂層，疏水性較高的QTiN和QSiC涂層組上牙齦卟啉單胞菌大大減少[5]。

細菌的黏附能力還受材料表面的帶電狀態(tài)直接影響。朱青青等人發(fā)現(xiàn)在口腔pH條件下一些細菌本身帶負電荷，與唾液中含量豐富的鈣離子(Ca2+)結(jié)合，通過靜電作用形成細菌—鈣—細菌的結(jié)合，使細菌附著于牙面上。同時，研究表明鈦摻雜類金剛石碳(Titanium doped diamond-like carbon，Ti-DLC)涂層中，隨著作為電子供體的鈦含量的增加，大腸桿菌和銅綠假單胞菌的黏附降低，主要是因為電子供體大的表面部分，增加了Ti-DLC涂層的負電荷，而這兩種細菌本身帶負電荷，因而與涂層產(chǎn)生了排斥反應(yīng)，其黏附下降[6]。

2.2.2 材料的表面形貌:除了材料本身的性質(zhì)之外，材料的表面形貌對細菌的黏附也起到了決定性的作用。

材料表面形貌的主要因素之一是表面粗糙度，細菌黏附通常和粗糙度成正比。James等人使用具有各種表面積和粗糙度的植入物，包括Natrelle(光滑表面)、Smooth Silk/Silk Surface(絲綢)、Velvet Surface(天鵝絨)、Siltex和Biocell等不同粗糙度的表面，在9個獨立實驗中評估了表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌和Pickalti菌3種細菌的附著。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與表面較光滑(光滑、絲綢和天鵝絨)的植入物相比，具有較粗糙紋理的植入物表面(Siltex和Biocell)的細菌黏附較多[7]。Tupinambá等人創(chuàng)建了等離子體聚合膜沉積物以修飾金屬正畸托槽，降低其表面粗糙度，抑制了細菌黏附[8]。

此外，材料表面的特征性結(jié)構(gòu)，也會影響細菌黏附的偏好性。王麗云等人在聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，PET)基底上構(gòu)建具有多圖案元素、尺寸梯度的三維規(guī)則結(jié)構(gòu)，包含彎曲邊緣、直邊緣、凸出柱體平面以及柱體之間的凹谷平面的三維規(guī)則形貌，并有六個尺寸梯度，系統(tǒng)研究不同培養(yǎng)條件下三維形貌對細菌黏附的影響，結(jié)果表明細菌對各圖案元素黏附時表現(xiàn)出的偏好性越小，菌體在該三維規(guī)則微觀形貌的黏附數(shù)量越少，其中對三維結(jié)構(gòu)曲率小的邊緣地帶表現(xiàn)出明顯的偏好性黏附。如果將此物理方法與抗生素或其他抑菌劑修飾表面的方法結(jié)合，即在此邊緣區(qū)域連接抑菌劑，既可以有效抑制細菌對表面的污染，又可以大大降低抑菌劑的使用劑量。表皮葡萄球菌RP62A(ATCC 35984)在聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)織造的聚尿烷(Polyurethane urea，PUU)表面上的黏附研究揭示結(jié)合紋理和PEG處理可減少細菌黏附。Schwibbert等人利用飛秒激光誘導(dǎo)的亞微米結(jié)構(gòu)修改聚乙烯(Polyethylene，PE)表面形貌，用大腸桿菌測試菌株對表面進行細菌定殖研究。結(jié)果表明，納米結(jié)構(gòu)使大腸桿菌的黏附性降低[9]。通過對特定表面進行圖案化來改變細菌的黏附性能，符合綠色環(huán)保的發(fā)展趨勢，是當前研究的重點之一。

2.2.3 材料的摻雜:用抗菌物質(zhì)對材料進行摻雜，也會大幅度提高材料的抗黏附性能。Silvestro等人利用透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)的不同百分比(1%～35%)來修飾殼聚糖(Chitosan，CS)，發(fā)現(xiàn)相比于未摻入HA的CS基質(zhì)來說，當摻入HA濃度≥5%時CS基質(zhì)能夠避免表皮葡萄球菌黏附[10]。Piarali等人通過在紡絲過程之前將聚羥基鏈烷酸酯紡絲溶液、合成抗菌肽Amhelin和酶Dispersin B添加到溶液中，將它們共價地偶聯(lián)到纖維上，形成活化的聚羥基鏈烷酸酯網(wǎng)狀物，接著感染表皮葡萄球菌。抗菌篩選結(jié)果顯示，用Amhelin和Dispersin B進行表面活化的纖維可使纖維表面上附著的細菌減少83%。呂夢萌等人發(fā)現(xiàn)洗必泰負載的銀修飾介孔二氧化硅納米粒子(The CHX-loaded, silver-decorated mesoporous silica nanoparticles，Ag-MSNs @ CHX)可以通過破壞細菌的生物膜，抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌生長，減少其黏附[1]。

2.2.4 細胞表面分子表達：當細菌在生物體內(nèi)定植時，其黏附表面通常是細胞表面，此時細胞表面某些分子的表達會影響細菌的黏附。對于細菌在細胞表面的黏附研究發(fā)現(xiàn)，Caco-2細胞被大腸桿菌O157：H7感染后，Caco-2細胞中的整合素b1升高。當Caco-2細胞整合素b1受到抗體阻斷或CRISPR/Cas9敲除時，其表面細菌附著減少。說明細胞表面的整合素起到了促進黏附的作用，這可能是因為被大腸桿菌O157：H7感染的細胞中，整合素會提高talin蛋白、paxillin蛋白和α-肌動蛋白等黏附(Focal adhesion，F(xiàn)A)蛋白的表達水平[11]。Huebinger等人使用嚙齒動物手術(shù)感染模型，在切口部位感染了銅綠假單胞菌，用結(jié)合到聚合物支架上的重組細菌黏附素——多價黏附分子(Multivalent adhesion molecules，MAM)片段制成MAM7抑制劑治療感染，結(jié)果顯示MAM7可以抑制最初黏附在組織手術(shù)切口中的細菌，其主要原因是該抑制劑會附著于宿主表面受體纖連蛋白和磷脂酸酯，通過競爭性排斥抑制細菌附著。

2.3 黏附環(huán)境 高溫、離子濃度和電等因素會影響細菌的黏附。高溫處理的唾液乳桿菌和植物乳桿菌，其黏附性顯著下降。主要是這兩種細菌對溫度敏感，熱處理時表面成分會發(fā)生變化，從而影響其黏附性。用鈣離子處理后的乳酸菌，其黏附能力顯著提高，可能是因為活化了鈣離子介導(dǎo)的信號通路，從而促進細菌與細胞表面受體間的特異性結(jié)合。通少量的直流電可以抑制細菌黏附，在直流電作用下，帶負電的細菌被推離陰極，沿著陽極表面運動，一部分細菌黏附在陽極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而死亡，沉積黏附的細菌數(shù)量會明顯減少。

3 細菌黏附的研究模型

細菌黏附的研究模型主要包括靜態(tài)模型和動態(tài)模型。靜態(tài)模型主要是利用待測物與細菌進行靜態(tài)共培養(yǎng)，然后測定并評價細菌黏附力。任婷婷等人將裸玻璃和各種帶涂層的玻璃加入含大腸桿菌懸液的24孔板中，在37℃下溫育，經(jīng)過洗滌、固定、脫水、干燥處理，通過SEM拍攝電鏡照片計算黏附的大腸桿菌的數(shù)量，反映細菌在不同涂層的黏附力[12]。同時，馬駿等人將光滑面、粗糙面的鈷鉻鉬合金和鈦合金四種試樣分別放入不同類型的培養(yǎng)板中，分別吸取異硫氰酸酯(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標記的表皮葡萄球菌和結(jié)核桿菌菌液滴入培養(yǎng)板內(nèi)，在恒溫箱中孵育，經(jīng)過洗滌，通過熒光顯微鏡觀察，對熒光面積進行計算，研究了細菌在不同試樣上的黏附情況，展示了細菌對人工關(guān)節(jié)假體的影響。另外，Nogueira等人將牙釉質(zhì)樣品分別放入24孔細胞培養(yǎng)板中，用變形鏈球菌接種，在37℃下孵育，經(jīng)過洗滌、超聲處理，在平板表面上涂布，37℃下孵育后，使用立體鏡對菌落形成單位進行計數(shù)，以此研究細菌在牙釉質(zhì)樣品的黏附力[13]。靜態(tài)模型雖然操作簡便，但也存在不足：培養(yǎng)環(huán)境封閉，細菌在研究過程中所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物和毒力因子等會使封閉環(huán)境發(fā)生顯著變化；受培養(yǎng)上清中浮游菌的干擾，難以采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行實時觀察[14]。

動態(tài)模型主要是模擬體內(nèi)真實環(huán)境，進行細菌黏附力的研究。王若茜等人將人支氣管上皮樣細胞(Human bronchial epithelial cells，HBE)接種至流動小室中，待其融合長滿小室，將熒光染料標記的鮑曼不動桿菌加入流動小室，接入流動系統(tǒng)，放置于熒光顯微鏡下觀察細菌在細胞上的黏附情況，以此研究細菌在呼吸道上皮細胞的黏附[14]。同樣，Paladin等人用銀對聚氨酯導(dǎo)管進行了處理，通入接種金黃色葡萄球菌的M9基本培養(yǎng)基，制成了復(fù)制人體的生理狀況的洗滌系統(tǒng)，使用綠色熒光核酸染料對導(dǎo)管進行染色，通過熒光顯微鏡研究了細菌在導(dǎo)管上的黏附[15]。動態(tài)模型雖然操作復(fù)雜，但動態(tài)模型更能夠模擬細菌黏附的生理生化微環(huán)境和力學(xué)環(huán)境，更加貼近體內(nèi)真實的動態(tài)環(huán)境，并且可實時觀察細菌在黏附材料上的黏附情況[14]。

綜上所述，細菌黏附對生產(chǎn)生活的諸多環(huán)節(jié)有著重要的影響，受到越來越多的關(guān)注，已成為研究的熱點。從細菌本身和材料兩個方面開展的諸多研究，使我們更加了解細菌的黏附機制，從而能夠根據(jù)應(yīng)用需要來抑制(如介入醫(yī)療器械)或促進細菌的黏附(如污水處理廠)。開發(fā)新的、環(huán)保綠色的抗細菌黏附或促進黏附的材料與制劑，是今后的主要研究方向。