膽汁酸作為生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)肝硬化診斷及預(yù)后判斷研究進(jìn)展

李倩，寧波

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400000）

0 引言

各種嗜肝及非嗜肝病毒、酒精、膽汁淤積、藥物或毒物等因素長(zhǎng)期作用于肝臟，可導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死、纖維組織增生等一系列改變，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，取而代之的是再生結(jié)節(jié)、假小葉結(jié)構(gòu)，肝臟血流受損，逐漸發(fā)展為肝硬化。病變逐漸進(jìn)展,晚期出現(xiàn)食管胃底靜脈曲張、脾功能亢進(jìn)、腹水、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝癌等多種并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì),1990年到2016年期間我國(guó)肝硬化及其他慢性肝病患者患患者數(shù)由六百萬(wàn)余人增加至一千一百萬(wàn)余人,增長(zhǎng)了73.7%,提示肝硬化及其他慢性肝病仍威脅著中國(guó)人的健康[1]。越來(lái)越多的研究表明,膽汁酸與肝損傷密切相關(guān),并在肝硬化患者血清、尿液及糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)部分膽汁酸水平發(fā)生了明顯的改變,且與肝硬化的病程分級(jí)和判斷預(yù)后具有相關(guān)性。提示肝硬化患者膽汁酸的靶向檢測(cè)對(duì)肝硬化的診斷、預(yù)后判斷有重要價(jià)值。這片文章對(duì)膽汁酸在臨床肝硬化診斷及預(yù)后判斷方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 目前肝纖維化診斷方法及其局限性

現(xiàn)有肝硬化診斷方法主要包括有創(chuàng)性及無(wú)創(chuàng)性檢查，無(wú)創(chuàng)性檢查又包括血清學(xué)及影像學(xué)檢查。（1）肝硬化血清學(xué)生物指標(biāo)的檢測(cè)包括了轉(zhuǎn)氨酶、Ⅲ型前膠原、透明質(zhì)酸、凝血因子、血小板計(jì)數(shù)等[2]。人們發(fā)現(xiàn)用單一的血清學(xué)生物指標(biāo)評(píng)估肝硬化存在較大的局限性，近年來(lái)包括FibroTest,FibroSpect II,Hepascore等數(shù)字模型在肝硬化的診斷及預(yù)后判斷方面起到了重要作用[3]。（2）影像學(xué)肝纖維化檢測(cè)指標(biāo)主要包括普通彩超，通過(guò)對(duì)肝臟的大小、肝實(shí)質(zhì)回聲、脾大小、有無(wú)腹水等方面對(duì)肝纖維化進(jìn)行判斷，但其受肥胖、呼吸、檢驗(yàn)者主觀判斷的影響較大[4]；超聲瞬時(shí)彈性成像，其主要是通過(guò)測(cè)定肝臟瞬時(shí)彈性圖譜來(lái)測(cè)量肝臟硬度值對(duì)肝臟纖維化的程度進(jìn)行判斷，但其受肥胖、肝外膽道梗阻、急性肝炎、腹水等影響[5]；近年來(lái)CT灌注成像（CTP）的研究顯示其有望區(qū)分正常肝臟、輕度肝纖維化及中度肝纖維化，但其應(yīng)用仍受電離輻射、對(duì)比劑劑量、研究樣本較少的限制[6]；常用的磁共振技術(shù)包括磁共振彈力成像（MRE），研究表明其對(duì)嚴(yán)重肝纖維化、進(jìn)展期肝纖維化及肝硬化的診斷準(zhǔn)確性高于瞬時(shí)彈性成像（TE）及體素內(nèi)非相干運(yùn)動(dòng)（IVIM）擴(kuò)散加權(quán) MRI，但炎癥、脂肪變性對(duì)肝臟硬度及IVIM參數(shù)存在一定影響[7]。（3）肝活檢已被稱為診斷肝臟疾病和評(píng)估肝纖維化或肝損害的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于肝穿刺活檢的侵入性和可能的并發(fā)癥，取樣變異性以及病理學(xué)家解釋的主觀性存在，使得其應(yīng)用受限制[8]。

2 膽汁酸作為生物學(xué)標(biāo)志物的潛力

膽汁酸由肝細(xì)胞經(jīng)一系列酶作用合成，初級(jí)膽汁酸包括膽酸（CA）和鵝去氧膽酸（CDCA），經(jīng)肝臟排出后進(jìn)入腸道被腸道菌群修飾，產(chǎn)生的次級(jí)膽汁酸包括去氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA），腸道中約95%的膽汁酸被腸壁重吸收經(jīng)門靜脈回到肝臟，經(jīng)肝細(xì)胞處理后與新和成的結(jié)合膽汁酸一起再經(jīng)膽道排入腸道中，這個(gè)過(guò)程成為膽汁酸的肝腸循環(huán)，而總膽汁酸（TBA）是20多種膽汁酸（IBA）的總和，是肝功能的生物標(biāo)志物和肝膽功能障礙或疾病的指標(biāo)[9]。未結(jié)合的BA，包括CA，CDCA和DCA更具疏水性，因此具有更大的細(xì)胞毒性，而DCA是最具毒性細(xì)胞毒性的膽汁酸之一[9]。當(dāng)肝臟膽汁酸排泄障礙時(shí)，將導(dǎo)致膽汁淤積，有毒膽汁酸（BA）的積累通過(guò)引發(fā)炎癥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起氧化應(yīng)激而導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭[10]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各種原因?qū)е赂渭?xì)胞損傷時(shí)，可影響膽汁合成及分泌，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，進(jìn)一步導(dǎo)致血清、糞便、尿液中膽汁酸組成較正常人存在差異。多個(gè)研究表明，在肝硬化患者血清中，總膽汁酸水平明顯升高且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。一項(xiàng)對(duì)丙型病毒性肝纖維化診斷的研究表明，TBA水平被認(rèn)為是肝纖維化嚴(yán)重程度良好預(yù)測(cè)指標(biāo)，血漿膽汁酸水平在臨界值為75.5 μmol/L時(shí)的ROC曲線對(duì)預(yù)測(cè)晚期肝纖維化具有59%的特異性和97.4%的敏感性(AUROC=0.78)[12]。另外有研究表明肝硬化患者血清中初級(jí)膽汁酸水平明顯升高，而次級(jí)膽汁酸水平降低，且與肝硬化疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。更有人發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清中TCA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為診斷肝硬化的陽(yáng)性生物學(xué)標(biāo)志物[14]。有實(shí)驗(yàn)表明，與正常對(duì)照組相比，肝硬化患者糞便中總膽汁酸水平更低、初級(jí)膽汁酸水平更高[15]。對(duì)肝硬化患者尿液中膽汁酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，尿液中總膽汁酸水平更高，GCA水平明顯升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。血清、尿液、糞便中膽汁酸的組成差異的特點(diǎn)提示其可作為肝硬化診斷及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

3 肝硬化患者膽汁酸的差異

3.1 肝硬化患者血清膽汁酸的差異

肝硬化患者血清膽汁酸的差異肝硬化時(shí)由于肝細(xì)胞嚴(yán)重受損、門脈高壓形成、多條側(cè)支循環(huán)形成,導(dǎo)致門靜脈中膽汁酸經(jīng)側(cè)支循環(huán)直接進(jìn)入體循環(huán)中，并且肝內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)及血供改變使得肝臟對(duì)膽汁酸的清除減弱,導(dǎo)致肝硬化患者血清中TBA濃度增加，且與Child-Pugh分級(jí)成正比，因此血清TBA可作為肝硬化患者肝功能分級(jí)及預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)[11,13,17,18]。Horvatits Thomas等人發(fā)現(xiàn)非膽汁淤積性肝硬化合并急性失代償（AD）和急/慢性肝功能衰竭（ACLF）患者血清TBA濃度明顯高于無(wú)AD/ACLF的患者，并且與肝病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，此外，與其他指標(biāo)相比，血清TBA水平與肝靜脈壓力梯（HVPG）相關(guān)性最好[19]。由于BA的合成、代謝和排泄受到肝臟疾病的影響，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究對(duì)單個(gè)膽汁酸（IBA）進(jìn)行監(jiān)測(cè)作為肝硬化診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。LIU等人發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清中GCA，GCDCA，TCA，TCCDA和TUDCA濃度顯著增加，這些單個(gè)BA可能是診斷肝硬化的潛在指標(biāo)，在進(jìn)行性肝硬化患者中，觀察到的主要變化是初級(jí)結(jié)合膽汁酸濃度明顯增加，而次級(jí)膽汁酸則呈下降趨勢(shì)[13]。LUO等人的研究同樣發(fā)現(xiàn)肝損傷患者血清中初級(jí)結(jié)合膽汁酸（GCA、GCDCA、TCA、TCDCA）濃度更高，而次級(jí)膽汁酸（DCA、TDCA、GDCA）濃度偏低[9]。這可能是因?yàn)楦斡不T脈高壓患者胃腸道淤血，腸道通透性和屏障功能破壞，腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致初級(jí)膽汁酸脫7α羥基障礙或7α脫氫酶活性條件改變，血清中次級(jí)膽汁酸比例顯著降低[20 21]。而Zhang等人發(fā)現(xiàn)TCA，TCCDA，TUDCA 和 GCA 是肝硬化患者血清中四種濃度變化最大的膽汁酸，并且TCA，TCCDA 和 GCA與Child-Pugh 分級(jí)呈正相關(guān)，提示這些膽汁酸可作為肝硬化疾病分層的生物標(biāo)志物，其中TCA濃度升高最明顯，對(duì)肝損傷的診斷價(jià)值最高，體外細(xì)胞試驗(yàn)表明TCA能促進(jìn)人LX-2細(xì)胞增殖，上調(diào)LX-2細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）、I型膠原和α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)，提示TCA能夠激活肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)肝硬化的發(fā)展[14]。一項(xiàng)對(duì)慢性乙型病毒性肝炎的研究表明，肝纖維化程度與TBA、TCDCA、TCA、GCDCA、GCA呈顯著正相關(guān)[22]。此外，Yang等人的研究發(fā)現(xiàn)，在酒精性肝硬化患者血清中，牛磺酸結(jié)合膽汁酸（如TCA、TCDCA、TUDCA）較甘氨酸結(jié)合膽汁酸（如GCA、GCDCA、GUDCA）濃度升高更顯著,這可能與蛋氨酸合酶（MTR）和半胱氨酸亞磺酸脫羧酶（CSAD）表達(dá)增加，導(dǎo)致蛋氨酸和牛磺酸合成增加，因此產(chǎn)生了更多的牛磺酸底物以與BA結(jié)合，使得酒精性肝硬化患者血清中牛磺膽汁酸濃度更高，提示血清牛磺酸結(jié)合膽汁酸/甘氨酸結(jié)合膽汁酸可作為預(yù)測(cè)酒精性肝硬化嚴(yán)重程度的非侵襲性標(biāo)志物[23]。Trottier等人對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）患者血清膽汁酸譜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TBA、甘氨酸結(jié)合初級(jí)膽汁酸、牛磺結(jié)合初級(jí)膽汁酸水平明顯升高，甘氨結(jié)合膽汁酸/牛磺結(jié)合膽汁酸比值水平明顯降低[24]。肝硬化患者血清膽汁酸差異主要表現(xiàn)為總膽汁酸、初級(jí)結(jié)合膽汁酸水平明顯增加，而次級(jí)膽汁酸水平降低[25]。

3.2 肝硬化患者糞便膽汁酸的差異

正常人每天經(jīng)糞便排泄的膽汁酸約300-600mg/天，經(jīng)糞便排泄的膽汁酸能夠?yàn)槿梭w的膽汁酸代謝提供豐富的信息，對(duì)糞便中膽汁酸進(jìn)行靶向檢測(cè)可以為膽汁酸的代謝異常類疾病的研究提供幫助[15]。Kakiyama等人發(fā)現(xiàn)晚期肝硬化患者糞便中膽汁酸濃度更低，提示膽汁酸合成減少，且健康受試者糞便主要膽汁酸為DCA和LCA，晚期肝硬化患者糞便膽汁酸主要由CA和CDCA組成，且DCA/CA和LCA/CDCA的比值與肝硬化Child-Pugh分級(jí)呈負(fù)相關(guān)[15]。此外Genta等人也有同樣的發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，肝硬化患者糞便中CA濃度更高，而TBA,DCA,LCA,DCA/CA,LCA/CDCA的濃度更低，并且隨著肝硬化進(jìn)展這種差異更明顯[25]。Wang等人的研究發(fā)現(xiàn)，與早期肝纖維化患者相比，伴中晚期肝纖維化的慢性乙型病毒性肝炎患者糞便中TBA、次級(jí)膽汁酸水平顯著降低[22]。這表明肝硬化患者糞便中TBA減少，且初級(jí)膽汁酸的濃度明顯高于次級(jí)膽汁酸濃度。這可能與腸道微環(huán)境相關(guān)，在回腸末端和結(jié)腸中初級(jí)膽汁酸被具有7α-脫羥基化酶的腸道菌群（如梭狀芽胞桿I簇、XI簇和XIVa簇，XIVa簇）脫羥基轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，而肝硬化門脈高壓患者常伴有胃腸道淤血，腸道屏障功能遭到破壞、通透性增加，使得腸道微生物改變，其中包括具有7α-脫羥基化酶的菌群失調(diào)，這種菌群參與初級(jí)膽汁酸向次級(jí)膽汁酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程，導(dǎo)致初級(jí)膽汁酸向次級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化障礙，因此肝硬化患者糞便中次級(jí)膽汁酸比例顯著降低[20]。此外，LIU等人發(fā)現(xiàn)，給肝硬化大鼠補(bǔ)充結(jié)合型膽汁酸可以促進(jìn)膽汁分泌，明顯降低了腸道菌群移位及血漿內(nèi)毒素水平，表明結(jié)合膽汁酸在腸道中去結(jié)合、去羥基過(guò)程中對(duì)細(xì)菌有抑制作用，而肝硬化患者膽汁酸流量減少，將進(jìn)一步導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[26]。

3.3 肝硬化患者尿液膽汁酸的差異

硫酸化被認(rèn)為是膽汁酸的解毒機(jī)制，尿液中膽汁酸主要與硫酸結(jié)合，其次是葡萄糖醛酸和氨基酸[27]。因肝硬化時(shí)肝臟對(duì)膽汁清除率降低，使得血清膽汁酸升高,導(dǎo)致經(jīng)尿液排出的膽汁酸增加,且尿液膽汁酸的測(cè)定不受進(jìn)食影響[28]。Chen等人通過(guò)對(duì)肝硬化、肝炎及健康對(duì)照者的尿液膽汁酸代謝分析發(fā)現(xiàn)，在患有肝硬化和肝炎的受試者尿液中，DCA濃度更高，而CA濃度明顯降低，此外，與健康對(duì)照組相比，肝硬化患者尿液中GCA濃度明顯更高，差異差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。Negoro等人通過(guò)測(cè)定66例慢性肝炎患者尿硫酸膽汁酸(USBA)水平及血清中TBA水平，發(fā)現(xiàn)USBA較TBA對(duì)肝硬化的檢出率更高，分別是40(61%)和26(39%)[29]。Miura等人通過(guò)對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）患者的診斷研究表明，USBA較血清TBA診斷PBC更準(zhǔn)確（82% vs 56%）[27]。Kawai等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，膽汁淤積和慢性肝損傷小鼠尿液膽汁酸濃度明顯升高，在預(yù)測(cè)膽汁淤積方面有一定作用[30]。但目前對(duì)肝硬化患者尿液膽汁酸代謝譜分析的研究較少，臨床工作中尿液膽汁酸的價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

目前肝組織穿刺活檢仍是診斷肝臟疾病和評(píng)估肝纖維化或肝損害的金標(biāo)準(zhǔn),但由于其創(chuàng)傷較大、價(jià)格昂貴，在臨床上應(yīng)用明顯受限。盡管已有較多的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法用于診斷及評(píng)估肝硬化，但近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明對(duì)肝硬化患者體液中的膽汁酸進(jìn)行靶向檢測(cè)有望使其成為與傳統(tǒng)生化指標(biāo)互補(bǔ)的有效診斷及評(píng)估手段。肝硬化時(shí)膽汁酸肝清除率明顯降低，門體分流可進(jìn)一步導(dǎo)致血清膽汁酸水平升高，肝硬化者腸道微生物失調(diào)，使得膽汁酸轉(zhuǎn)化障礙，改變了體液中膽汁酸譜；此外，膽汁酸可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重肝損害。但目前大部分研究均是以肝硬化患者血清、糞便為標(biāo)本對(duì)膽汁酸進(jìn)行靶向檢測(cè)，因膽汁酸不易獲得，目前極少是以膽汁為檢測(cè)標(biāo)本的研究，盡管血清及糞便較膽汁易獲得，但易受其他因素的影響，不如以膽汁為標(biāo)本更精確。更值得我們期待的是，未來(lái)通過(guò)合理的樣本采集，對(duì)肝硬化患者膽汁中膽汁酸進(jìn)行分析，將有望使膽汁酸成為肝硬化臨床診斷及預(yù)后判斷的重要血清學(xué)指標(biāo)。