微小RNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變

陶丹，倪寧華

（1.昆明市兒童醫(yī)院/云南省兒科疾病臨床醫(yī)學(xué)中心/云南省兒童醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院，云南 昆明 650031；3.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

Lee等[1]于1993年率先于線蟲發(fā)育期間檢出了首個微小RNA(microRNA，miRNA)，并將其被命名為lin-4。之后，學(xué)者們自多個生物物種內(nèi)皆檢出了miRNA。截止當(dāng)前在人類基因量中已完成克隆排序的數(shù)量超過了800個，預(yù)估m(xù)iRNA基因量＞1000個，此外所調(diào)控的人類基因所占比例已超過了30%[2]。miRBase數(shù)據(jù)庫（構(gòu)建方為英國Sanger研究所）[3]在記錄miRNA序列諸數(shù)據(jù)庫中，其最具權(quán)威性，截止當(dāng)前，此數(shù)據(jù)庫所收錄的成熟miRNA序列信息類型已達25141種，涉及到193個物種。在動物基因總量中，miRNA為1%至5%占比[4]，就人類基因組而言，估計編碼mRNA量在1000個以上，判斷miRNA所調(diào)控的蛋白編碼基因占比已達1/3以上[5]。

miRNA是一類單鏈ncRNA（非編碼RNA）小分子，此分子長度約為20-24個nt（核苷酸），轉(zhuǎn)錄自內(nèi)源性發(fā)夾型[6]。對于任何蛋白質(zhì)，miRNA皆無編碼作用，其在調(diào)控基因表達方面體現(xiàn)出一定的新穎性。單個miRNA可對若干個mRNA表達施以有效調(diào)節(jié)；而且六成以上的mRNA含若干條miRNA的結(jié)合位點，能夠同時與若干miRNA發(fā)生交互反應(yīng)。miRNA存在以下特征表現(xiàn)：高度特異性、保守性、表達的時序性。基于生物學(xué)層面分析，miRNA存在十分復(fù)雜的合成過程[7]，首先，在細胞核內(nèi)，在RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)下，經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成“發(fā)夾”pri-miRNA，此物質(zhì)具備特征性莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被Drosha/DGCR8此蛋白復(fù)合體核心區(qū)域基因識別與切割，產(chǎn)生premiRNA。核-胞質(zhì)穿梭蛋白對其具識別性，并對其遷移至胞質(zhì)具促進作用，受到核糖核酸Ⅲ Dicer的刺激，等到留存住較短的(21-23)nt雙鏈RNA序列，再和Ago蛋白結(jié)合，完成向RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）轉(zhuǎn)化。此復(fù)合體的成熟態(tài)能夠互補配對結(jié)合靶mRNA的3’非編碼區(qū)(UTR)，對靶mRNA表達進行阻抑，進而抑制或降解靶mRNA翻譯。

近期，證實對于糖尿病（diabetes mellitus，DM），miRNA發(fā)揮著關(guān)鍵性的參與與調(diào)控作用。miRNA同T2DM存在顯著相關(guān)性。其可對胰島B細胞功能和胰島素的釋放施以影響。經(jīng)研究，學(xué)者Latreille等發(fā)現(xiàn)[8]，對于胰島B細胞生成胰島素的功能，miRNA-7a發(fā)揮著負向調(diào)控效應(yīng)，將小鼠B細胞所含miRNA-7a作敲除處理，可以提升胰島素分泌量。在miRNA-187表達量方面，同正常群體相比，T2DM患者偏高，此基因表達提升，能夠積極調(diào)控HIPK3，進而使胰島素釋放受抑，可見經(jīng)由抑制miRNA-187表達，可對T2DM施以有效治療[9]。Karolina等[10]對GK大鼠開展了相關(guān)研究，結(jié)果表明，相較于健康組大鼠，糖尿病組的實驗動物在29類miRNA的表達上，表現(xiàn)出了明顯的差別，這些miRNA中，脂肪組織內(nèi)miRNA-222以及miRNA-27a顯示表達增強，肝組織內(nèi)的miRNA-195以及miRNA-103也顯示為表達上調(diào)。miRNA-10b于肌肉細胞內(nèi)的表達偏低[11]，miRNA-146a于外周血單核細胞內(nèi)的表達偏低[12]。此外，Kong等[13]對DM患者血漿內(nèi)miRNA進行測定的結(jié)果顯示，miRNA-9、miRNA-3757、miRNA-29a、miRNA-146、miRNA-30d、miRNA-124a與miRNA-34a皆出現(xiàn)了變化。miRNA-320能夠調(diào)節(jié)T2DM患者細胞中由高糖刺激所致的基因表達量。受到高糖刺激，血管內(nèi)皮細胞（VEC）的VEGF、ET-1表達皆呈升高表現(xiàn)。

借助微陣列技術(shù)，學(xué)者Xu等[14]率先自成年小鼠內(nèi)提取出80個類型不同的miRNA，其中23個特異性表達于視網(wǎng)膜。近些年，受到NGS（新一代測序技術(shù)）發(fā)展與應(yīng)用的影響，miRNA檢出的敏感性顯著提升，于視網(wǎng)膜內(nèi)檢出了250個以上的miRNA[15]。

視網(wǎng)膜新生血管的產(chǎn)生，還有血管通透性提升皆為糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic Retinopathy，DR）形成的關(guān)鍵機制。VEGF在DR病理反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的影響，若此因子水平增強，能夠促進血管生成，同時可提升血管通透性。待VEGF結(jié)合了細胞表面相應(yīng)受體，可使細胞中若干信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，促使內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及新生血管腔的產(chǎn)生。Kovacs等[16]對比檢測了正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)86種miRNA在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中有顯著差異性表達，這與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生密切相關(guān)。還證實因VEGF誘導(dǎo)的6類miRNA（包括miR-17-5p、miR-155、miR-18a、miR-31、miR-21與miR-20a）皆高表達于DR大鼠的REC（視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞），表明miRNA可能經(jīng)由上調(diào)VEGF表達而影響DR形成的病理活動。經(jīng)研究，McArthur等[17]證實，miR-200b低表達于高糖干預(yù)的內(nèi)皮細胞與DM大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)，而其施以直接靶向作用的VEGF基因的蛋白、mRNA表達水平皆上調(diào)。學(xué)者Murray等[18]對大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞采取了誘導(dǎo)處理，所用誘導(dǎo)劑為miRNA-200b增強劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同存在一定聯(lián)系關(guān)的4-羥基壬烯醛（4-HNE）此氧化應(yīng)激源顯示為程度不等的增加，可見，在視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激（OS）機制中，miRNA-200b發(fā)揮著抗細胞凋亡效能，同時發(fā)現(xiàn)miRNA-200b還能作用下游的抗氧化1(oxidation resistance 1，Oxrl)基因，從而對DM起到保護作用。另外，內(nèi)皮細胞中miRNA-1表達下降，使得其靶基因ET-1與FN（纖連蛋白）水平提升，引發(fā)眼底視網(wǎng)膜血管收縮和纖維沉淀[19]。

NF-κB在REC增殖以及表達諸多類型的炎癥相關(guān)基因方面，發(fā)揮著調(diào)控樞紐作用，同DR的形成、進行存在顯著聯(lián)系。miRNA和視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)存在聯(lián)系。對于NF-κB炎癥通路，miR-146a起到一定調(diào)節(jié)作用[20]。相關(guān)實驗結(jié)果表明，對DM小鼠的REC具備誘導(dǎo)作用的miR-146、miR-21、miR-132以及miR-155存在不斷升高表現(xiàn)，導(dǎo)致REC-NF-κB途徑的活化，從而促進其下游基因MCF-1以及黏附因子-1的轉(zhuǎn)錄提升，對視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)施以進一步激發(fā)。Ye等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在高糖培養(yǎng)的HRCEC中表達下降,而過表達miR-146a能夠使TLR4/NF-κB以及TNF-α下調(diào)，表明在DR炎癥機制中miR-146a參與了NF-κB活化的負性調(diào)節(jié)。Feng等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在1型糖尿病大鼠模型中REC的表達減弱，纖維黏連蛋白（FN）則表達上調(diào)，促使視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞遷移、損傷，引起相關(guān)DR的病理改變。

對于DR而言，其神經(jīng)損傷改變以神經(jīng)凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生為主。先出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞機能異常[23]、神經(jīng)元細胞凋亡，再發(fā)生視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞與周細胞的凋亡[24]。在DR中，若p53活化，會增強miR-34家族(miRNA-34a/b/c)表達，表明，miR-34家族同由p53誘導(dǎo)所致的REC凋亡存在一定聯(lián)系。He等[25]敲除老鼠miRNA-34基因發(fā)現(xiàn)p53誘導(dǎo)的細胞凋亡被阻滯，表明在p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miRNA-34扮演著重要的角色。通過研究，Kovacs等[73]也發(fā)現(xiàn)miRNA-34c在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜色素上皮細胞中表達有顯著上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)在DR中有p53的活化，因此認為由miRNA-34家族成員介導(dǎo)的p53誘發(fā)的細胞凋亡和神經(jīng)退變參與了DR的發(fā)生發(fā)展。

循環(huán)miRNA指的是血清、血漿等體液樣品內(nèi)的miRNA。循環(huán)miRNA穩(wěn)定存在且持續(xù)表達于人類外周血內(nèi)，具備穩(wěn)定性[26]、組織特異性、可重復(fù)性，同時可經(jīng)非創(chuàng)傷性途徑獲得[27]。基于此類表現(xiàn)，循環(huán)miRNA具備成為診斷臨床各類疾病的新型生物標(biāo)志物的潛力[28]。Chen等[29]的研究結(jié)果顯示，DM血清和血細胞所含miRNA中有84類是相同的，對于DM患者而言，其血清miRNA改變相較血細胞miRNA改變特異性、敏感性皆更強。

現(xiàn)今已有大量循環(huán)miRNA被當(dāng)做生物標(biāo)志物用在其他疾病的診斷中。通過研究，Wulfken LM等[30]發(fā)現(xiàn)，可將miR-1233當(dāng)做腎細胞癌的潛在生物標(biāo)志物。經(jīng)研究，Luo[31]發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清樣本內(nèi)存在miR-221高表達表現(xiàn)。Lee等[32]的研究結(jié)果顯示，可通過miR-146b、miR-222來標(biāo)志甲狀腺癌復(fù)發(fā)。Li S等[33]對于早期檢測高血壓具備標(biāo)志價值。Zampetaki A等[34]的研究顯示，miR-15a、miR-28-3p、miR-29b、miR-223與miR-126等具備早期診斷T2DM價值。

DR中患者的視網(wǎng)膜細胞、外周血血清內(nèi)也分布著大量異常表達的miRNA[35]，這些miRNA在DR的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用,有的可以促進DR的發(fā)生，有的對DR發(fā)生起到抑制作用。目前的研究主要集中在動物模型中表達的組織miRNA，關(guān)于miRNA在DR疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機制所見較少。雖然目前的研究已經(jīng)揭示了miRNA的表達與DR的發(fā)展之間的聯(lián)系，但miRNA可否作為DR的早期預(yù)警、早期診斷及早期干預(yù)的生物學(xué)指標(biāo)尚無定論。