hWAPL基因在宮頸癌與宮頸上皮內瘤變中表達的意義

雪雨田，王亞琴，姜向陽

（西安醫學院研究生處，陜西 西安 710000）

1 hWAPL基因的概述

WAPL是在黑腹果蠅體內于1977年第一次所發現，位于果蠅體內的X染色體上2D5-2D5[2]，以增加連接蛋白分離。WAPL基因在人類中的同源基因被稱作半翼基因（human wings apart-like，hWAPL），hWAPL基因位于染色體10q23.2位點，長約86528bp，含有17個外顯子和2個內含子，其所編碼的hWAPL蛋白與WAPL蛋白在保守區域具有高度同源性，同時二者具有極為相似的功能作用，其調節染色質的結構，維持姐妹染色單體的穩定性[3]。近年來，研究發現hWAPL僅在宮頸癌患者的宮頸組織中具有較高的表達特異性，與宮頸癌的發生具有密切的相關性，日本學者Oikawa等[4]應用Northern印跡雜交實驗對宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌及其相應的正常組織中的hWAPL基因中mRNA表達水平進行檢測，發現與其他癌組織及其相應的正常組織進行比較，只有在宮頸癌組織中hWAPL基因的mRNA表達具有明顯的高表達。對于癌細胞系的研究也發現，hWAPL在宮頸癌細胞系表達的程度更高。證明宮頸癌特異性高表達的基因是hWAPL基因。國內魯笑欽等[5]采用免疫組化方法檢測27例正常宮頸、47例宮頸癌及238例其他8種癌組織中hWAPL基因的表達，hWAPL基因在正常宮頸和宮頸癌組織中的陽性表達率分別為33.70%和97.87%。研究表明，在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中，隨宮頸病變程度的加深，hWAPL的免疫積分及陽性表達率逐步升高，hWAPL基因在正常宮頸上皮細胞中不表達或表達僅局限于少量基底層細胞及基底旁細胞。hWAPL在CINⅠ和CINⅡ的樣本中的表達占上皮厚度的50%～70%，而在hWAPL的表達在CINⅢ和浸潤性鱗狀上皮癌中整個病變上皮。此外，隨著病變程度增加，hWAPL的表達水平也隨之升高，證明hWAPL與宮頸病變的嚴重程度密切相關。由于檢測到hWAPL在腫瘤組織中高水平的表達，為了明確在腫瘤的發生中是否hWAPL的過度表達有促進作用，在體外實驗中，Oikawa等[6]將血凝素(HA)標記的hWAPL表達載體(HA-hWAPL 3T3)或HA表達載體 (HA-3T3)轉染小鼠成纖維細胞，并將轉染的細胞分別注射到裸鼠體內，觀察經注射后的裸鼠的成瘤情況，結果表明，轉染HA表達載體的裸鼠未發生腫瘤，而HA-hWAPL 3T3的裸鼠幾乎都有發生腫瘤。這證明hWAPL是致瘤性的。在正常小鼠睪丸組織中含有大量的WAPL蛋白，在人類各正常組織的檢測也發現相似的情況，人睪丸組織中顯示出大量hWAPL mRNA，而其他正常的人類組織中也檢測出表達微量的hWAPL mRNA。哺乳動物的WAPL基因對二嗯英很敏感，可以降低使hWAPL蛋白的表達，從而影響精子的發育。在小鼠體內hWAPL基因還與胚胎的發育有關。抑制SiHa細胞中 hWAPL基因表達可導致細胞死亡。HPV或其他因素導致的hWAPL異常表達可導致DNA斷裂或不準確修復，存活細胞中的基因重排或多倍體形成，基因組不穩定性從而導致細胞的惡性轉化和胚胎發生缺陷。

2 HPV與宮頸癌的關系

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種常見的嗜黏膜、皮膚的微小DNA病毒，無包膜，在分化狀態的細胞中復制，其分子為雙鏈環狀，并呈現以共價閉合的高度螺旋化，病毒基因組含有8000左右堿基(bp),由早期區（early region，E)、晚期區(late region，L)、長控制區（long control region，LCR)。早期區含有E1、E2、E4、E5、E6、E7共6個基因，是維持病毒復制，編碼病毒蛋白，是維持細胞內病毒的高拷貝數基因[7]。其中E2基因的丟失或滅，導致E6、E7編碼的蛋白持續表達和過度表達。高危型HPV最為典型的特點是由E6、E7原癌蛋白來實現誘導終末分化細胞中DNA的合成；E6、E7區為多數HPV亞型的轉錄起始點，協助參與病毒細胞轉化及轉錄激活，可分別與p53、pRb抑癌基因結合形成復合體，使p53、pRb抑癌作用消失，細胞永生化，與HPV的致癌作用密切相關[8]。病毒基因主要通過染色體易位、缺失、重排和非染色體損害等方式整合到宿主細胞染色體中。染色體突變可激活癌基因和抑癌基因失活。持續感染HPV病毒的人群是高級別宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的高危人群。其原因可能與病毒整合后逃脫機體細胞識別清除、E2負調節蛋白缺失的腫瘤抑制因子[9]。HPV-DNA 在宮頸上皮細胞內的形態主要分為三種：游離型、整合型和二者兼有的混合型。研究發現，低級別上皮內瘤變(CINⅠ)的HPV-DNA呈游離狀態，高級別上皮內瘤變(CINII-Ⅲ)與宮頸癌中HPV-DNA多呈整合狀態，且整合率隨病變加重而顯著增加[10]。在過去的幾年里，為篩查宮頸癌，人類開發了大量的檢測高危型HPV的新方法，目前用于檢測HPV整合的方法有：熒光原位雜交法(fluorescence insitu hybridization，FISH)、雜 交 捕 獲 法(hybridcapture method，HC)、 Southern 印跡雜交法、連接-介導-PCR 法、多重實時熒光PCR 法、多重連接依賴式探針擴增法 (mult-i junction dependent probe amplification，MLPA)及致癌基因轉錄子擴增法(amplification of papillomavirus oncogene transcript test，APOT)等。多重實時熒光PCR法是應用最為廣泛的方法，該方法是利用不同的熒光基因簇，標記E6和E2基因探針，收集 E2/E6 的不同基因拷貝數，實現病毒的定量。其原理主要為HPV病毒整合后使E2破壞、缺失，E6/E7過度表達，E2的缺失和宮頸病變程度呈正相關，E6/ E7與p53及pRb結合，抑癌作用消失或減弱，導致腫瘤發生。多重實時熒光 PCR法具有高通量和高靈敏度的優點，可避免一定的重組樣本誤差，因此目前得到了廣泛的應用[11]。HPV感染可分為單一亞型感染和多重亞型感染，其中多重亞型感染者發生宮頸癌的概率要高于單一亞型感染者。感染亞型也存在地區和民族差異，在世界范圍內 HPVl6和HPVl8為最主要的人群感染亞型，而中國人當中HPVl6、HPVl8、HPV52、HPV58、HPV31、HPV33為最常見的亞型，并且中國南方地區 HPV52、HPV58亞型的感染率較北方地區要高[12]。HPV感染以單一感染為主，感染率隨感染亞型增多而下降，一般無四重及四重以上感染，而在多重感染中HPVl6合并型高達41.3%。HPV感染率隨宮頸病 變程度加深而增加，有研究顯示HPV感染率在宮頸炎中為51.2%，CINⅠ級為77.8%，cIN2級為 92.3%，CIN3級為100%，浸潤癌為100%[13]。Leyendecker 等[14]研究發現 HPV1 6-DNA的整合狀態與宮頸癌臨床分期、病理類型、組織學分化及預后無明顯相關性。Gargiulo等[15]研究結果表明，高危型HPV多重感染發展為高級別上皮內瘤變及宮頸癌的風險是高危型HPV單一感染的4倍。另有研究發現，高危型HPV多重感染可增加宮頸上皮內瘤變的風險，但與宮頸癌發生相關性低，在宮頸癌中更常表現為高危型HPV單一感染而非高危型HPV多重感染[16]。Cheung等[17]在HPV16、18雙重感染的宮頸癌中發現，HPV-DNA多為混合型，較HPV16或HPV18單一感染的整合率低。

3 hWAPL與HPV的關系

大量研究普遍認為，HPV感染是宮頸癌和大部分CIN的主要原因，hWAPL基因的表達受HPV早期蛋白的影響，HPV E6、E7可分別引起hWAPL表達的升高，也可以聯合引起hWAPL表達的升高，但E6和E7聯合作用與E6、E7單獨作用對hWAPL表達的生高水平無明顯區別。因HPV E2蛋白可與HPV早期啟動子結合抑制E6、E7的表達，為了證明hWAPL的表達是由E6和E7引起的，Kuroda[18]等分析了E2對hWAPL表達的影響，用編碼E2的逆轉錄病毒去轉染表達HPVE6、E7宮頸癌細胞株如與HPV陰性的宮頸癌細胞株C33A，結果發現CaSki和SiHa細胞株中hWAPL的表達水平顯著降低，而在C33A細胞株中hWAPL的表達沒有明顯改變。這些結果表明hWAPL的表達可能是對HPVE6和E7所引起特殊癌前細胞周期的一種反應。在HPV陽性的正常宮頸組織中hWAPL的表達較低，但無論在HPV陽性還是陰性的宮頸癌細胞中，hWAPL均表達較強，同時也可推測出相比HPV，hWAPL基因的過表達也許是宮頸癌發生的直接原因。有研究發現[19]，在宮頸癌病變中hWAPL蛋白可明顯高表達，提示宮頸癌的發生和發展可能有hWAPL蛋白的參與，可能通過影響以下因素導致相關指標的異常表達進而促進臨床病理特征的進展(1)通過hWAPL蛋白的表達可以增加早期宮頸柱狀上皮細胞分裂的異常，增加癌細胞的分化和誘導凋亡障礙，減少癌細胞的凋亡，顯著提高生長速度；(2)通過維持腫瘤干細胞的特性，hWAPL蛋白可以提高癌細胞的浸潤和侵襲能力。ShruthiPS等研究者在探討不同臨床病情的宮頸癌患者發病機制的過程中，發現hWAPL蛋白的平均表達陽性率可平均可提高25%以上，發現治療敏感性較差、治療后緩解率低的患者，hWAPL表達率更明顯[20,21]。同時免疫組化分表明：hWAPL蛋白主要位于癌細胞包質中及其周邊，表明hWAPL蛋白可能影響癌細胞之間的信號通路，同時干擾細胞內信號傳導等，從而促進了宮頸癌的發生。蔣文琛等[19]探討hWAPL蛋白與宮頸癌患者臨床病理特征的關系過程中發現，在細胞分化程度較差、發生淋巴結轉移或者臨床分期較晚的患者中，hWAP蛋白的表達陽性率較高，這可以從下列幾個方面進行理解：(1)hWAPL蛋白上調淋巴結內皮粘附分子adherin1的表達，能夠增加宮頸癌細胞通過宮旁、閉孔淋巴結等轉移風險；(2)hWAPL浸潤鄰近宮旁組織的浸潤，或陰道壁可能會增加宮頸癌患者的臨床分期。在宮頸癌浸潤脈管組織的患者中，hWAPL蛋白的表達陽性率可進一步提升，這可能與hWAPL蛋白對于癌細胞的變形、擴散及滲透作用的促進作用有關。

4 展望

宮頸癌的發生是一個多因素，多機制，多階段的漫長過程，有研究發現大約30%的女性一生中可能感染一次HPV，主要集中在年輕、性生活活躍的女性中，20-30歲為高峰期，多數女性感染后一段時間后無需治療，靠自身免疫力會在1-2年內自行消失。只有僅少數女性呈現出持續感染，通常需要8-15年發展為子宮浸潤癌。在這個漫長的過程中完全可以通過早期篩查來早發現、早診斷、早治療[22]。目前在臨床上的宮頸癌的篩查項目主要為：HPV聯合TCT的檢測，TCT是一種細胞學檢查，檢測已發生細胞形態學改變的情況，其受主觀性影響比較大，容易出現假陰性。而HPV檢測，直接測定的是病毒DNA基因分型，特異性強，準確性高[23]。據劉金鳳等人的調查發現[24]，中國相關文獻Meta分析中調整后宮頸癌HPV感染率82.7%。從而也說明在有些宮頸癌患者中，篩查HPV的結果為陰性。證明有一定的漏檢率，在一定程度上可造成宮頸癌患者漏診，但在HPV陰性的宮頸癌組織中hWAPL是高表達的，目前WAPL基因在宮頸癌組織中表達的研究尚不深入，但有學者認為可將HPV與血清中hWAPL表達的蛋白產物聯合篩查，可提高宮頸癌的確診率，同時有助于宮頸癌的早發現，早診斷，早治療，早康復，可提高患者的五年生存率。綜上所述在惡性宮頸癌方面的診治是一個新興領域，有廣闊的應用前景，可被推廣。