視網膜母細胞瘤動物模型建立方法的研究進展

李 韻，李 娜(綜述)，李 恒，白夢天*(審校)

(1.四川省遂寧市中心醫院腫瘤中心，四川 遂寧 629000;2.四川省遂寧市中心醫院眼科中心，四川 遂寧 629000)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是幼兒常見的眼內惡性腫瘤。在發達國家，超過90%的RB患兒可獲得良好預后且具備良好的視功能，我國RB患兒的長期生存率僅有63%，而在其他落后國家與地區，RB患兒病死率竟高達50%～70%[1]。迫切地需要建立統一規范的早期診斷策略與有效的治療方案，以期降低全球RB患兒平均病死率、延長生存時間以及改善視功能。動物模型不僅在促進深入認識RB發病機制與分子遺傳學上發揮了重要作用，也為RB的早期診斷及治療方案的不斷優化提供了有力的保障。構建RB動物模型需考慮模型的有效性、遺傳性、生物穩定性、宿主動物內的免疫原性、系統的可預測性、可重復性以及模型動物的生存時間等問題[2-3]。當前，RB動物模型的構建方式主要有三種：①異種植入的移植瘤RB模型；②轉基因的RB模型；③基因敲除RB模型。然而，目前尚沒有一種造模方法能夠完美地模擬人類RB的發生及發展，不同動物模型均存在各自的特點及局限性。因此，筆者將對異種植入的移植瘤RB模型、轉基因的RB模型、基因敲除RB模型進行綜述。

1 異種植入的移植瘤RB模型

目前，已有多種構建RB移植瘤動物模型的方法被報道。常用的模型動物為小鼠、新生SD大鼠、斑馬魚及新西蘭白兔等，而嚴重聯合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID mice)成功率較高(68.8%)[4]。此外，由于兔眼同人眼具有相似的容積，因此兔眼常用于RB移植瘤影像學研究。目前，最常用的RB細胞注射方法為前房注射、玻璃體腔注射以及視網膜間隙下注射。使用前房注射RB細胞操作簡單，且能較好地觀察和取材腫瘤，但前房的物理和免疫環境均不同于眼后段[5]。盡管采用視網膜下間隙注射法可確保RB細胞在眼后段生長，但該法技術要求高，腫瘤不易直接觀察，常需構建熒光蛋白進行示蹤[6]，且在操作中極易損傷脈絡膜和視網膜。近年來，Xiong等[7]采用皮下注射法構建模型，該法造模方法簡單，操作風險低，但常引起視網膜之外的腫瘤發生。而玻璃體腔注射法操作相對簡單，可較好地模擬腫瘤生長環境，并且觀察腫瘤相對方便，因此成為目前運用最廣泛的方式[5]。

McFall等[8]將Y-79和WERI-RB細胞分別注入經免疫抑制后的兔眼的前房中，成為最早成功構建RB移植瘤模型的研究者之一。Chévez-Barrios等[9]進一步研究發現，不同于WERI-RB細胞，Y-79細胞更易經視神經向腦部轉移。目前普遍認為，移植瘤模型RB細胞的生長部位取決于腫瘤細胞注射的部位。但Lemaitre等[4]發現，采取玻璃體腔注射后腫瘤生長更快，而即使將RB細胞注射于視網膜下間隙，RB細胞也易侵入玻璃體腔生長，因此他們認為采取玻璃體腔注射可與視網膜下注射取得相似的RB動物模型。模型動物經放射、胸腺切除或藥物處理致其免疫系統受損，使得移植瘤模型成功率上升[10]。而直接使用裸鼠和SCID小鼠不僅可免于對模型動物免疫系統的破壞，還能最大限度地保持RB細胞的組織學和生物完整性[11]。RB細胞注射后2周可見視網膜生長白色腫塊，注射后3～5周RB侵入玻璃體及前房，病理下可見大量RB細胞浸潤[5]。

異種植入移植瘤模型造模方式相對簡單，經濟成本相對較低，是目前構建RB動物模型使用最廣泛的方法。此外，該模型直接將人類RB細胞進行移植，可重復性好，腫瘤組織學特性以及對藥物的反應性更加接近人類RB患者[12-13]，因此成為可快速有效地篩選潛在藥物的模型。

2 轉基因的RB動物模型

視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)是相對分子質量為105 000的磷酸蛋白，屬于“囊袋蛋白”家族[14]。具有DNA病毒蛋白譜的pRB復合物又被稱為病毒癌蛋白(viral oncogene)，主要包括腺病毒5型癌蛋白、猿猴病毒40T抗原(simian virus 40 large T-antigen,SV40-Tag)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16型和18型的E7蛋白[15]。該類病毒可將自身DNA整合至宿主細胞的基因組從而轉化細胞，因此，常用于RB轉基因動物模型的構建。將外源性DNA序列以非同源重組的方式與啟動子耦合后微注射至受精卵中，并將其轉移至假孕的雌鼠子宮內，則一部分子代可攜帶和穩定表達轉基因性狀，并將該性狀穩定地向后代傳遞，由于轉基因RB小鼠具有較好的自發性，因此常作為模型動物。

在轉基因RB動物模型中，常以SV40-Tag作為啟動子標記基因。Windle等[16]將SV40-Tag與黃體生成素β-T抗原(luteinizing hormone β-Tantigen,LHβ-Tag)共雜交，成功構建了第一個RB轉基因小鼠模型。該研究發現被標記基因在垂體前葉分泌的促性腺激素中持續表達，并在5個月后形成雙側性RB。SV40基因組在大T區和小T區具有癌基因表達，均通過與P53、pRB家族結合而引起組織的腫瘤發生。該腫瘤亦表現出內生性和外生性，其不斷向玻璃體腔、視網膜、脈絡膜以及視神經進展[17]。此外，以視黃醛受體結合蛋白啟動子標記的RB轉基因動物則多表現為神經元特性，電鏡下觀察5月齡小鼠可見與人類RB常見的F-W薔薇花(Flexner-winterstainer)型和H-W薔薇花(Homer-Wright)型[18-19]。HPV E6可與P53結合從而抑制其功能，而HPV E7則與pRB、P107、P130結合而將其降解。運用HPVE6和HPVE7的靶向結合構建的動物模型為研究RB發生機制提供了獨特的方式[20]。

Tag轉基因模型已成為研究RB發生的重要工具。然而，病毒癌基因蛋白與其他組織蛋白的相互作用機制尚不清楚，因此其腫瘤發生的特異性低于移植瘤模型。

3 基因敲除(knockout，KO)RB模型

KO動物模型以小鼠多見，其通過同源重組技術，將外源基因與靶向基因載體相結合，而使靶向基因被替換或功能喪失，KO技術極大地推動了RB動物模型的發展。但早期RB KO小鼠多表現為中樞神經系統(central nervous system，CNS)腫瘤而非RB，視網膜則多表現為異位有絲分裂以及大量細胞變性[21]。當時已有研究者認識到P107可在RB1失活時發揮抑癌作用[22]。MacPherson等[23]發現新生乳鼠視網膜缺乏RB1時，P107表達持續上調。但同時缺乏RB1、P107及P53的小鼠并不會產生光感受器的惡變，通過構建巢蛋白、Chx10、Pax6啟動子以選擇性敲除視網膜組蛋白，于3～9個月后，在視網膜出現肉眼可見的腫瘤團塊。其中，巢蛋白-Cre KO小鼠可見雙側RB，且組織結構和人類RB類似，并向眼外肌和視神經侵犯[24]。

RB1/P107雙敲除(double knockout，DKO)小鼠的視網膜細胞出現大量凋亡表型，但仍有眾多水平細胞和無長突細胞存活，但并未檢測到RB細胞凋亡[25]。這與人類RB發生及其相似。在RB/P130 DKO模型中，出現腫瘤發生延遲和較低的外顯率。而P130在視網膜的發育、細胞周期調控與腫瘤抑制方面均發揮了重要作用[26]。RB1/P107和RB/P130 DKO RB模型均可見RB細胞沿視神經侵犯腦部，這與人類RB的轉移方式具有相似性[27]。

RB KO動物模型腫瘤發生于人類RB患者相似，該模型使得人類RB的生物學特征在動物模型上得到很好的重現[28]。此外，RB KO模型可較好地模擬人類RB的發生和轉移。與移植瘤模型相比，RB KO模型腫瘤生物力學、腫瘤微環境、腫瘤的侵襲和轉移以及對腫瘤治療策略的篩選更為可靠[29]。

4 小結與展望

人類RB的發生不僅受到機體的調控，也與生活和工作環境、飲食習慣密切相關，盡管RB動物模型的構建有不同方式，但均存在局限性。移植瘤模型動物多存在免疫抑制甚至免疫缺陷，腫瘤也并非原發性，移植部位也并非人類RB生長部位。而Tag轉基因模型操作較復雜、困難，造模預算較高且無法表現出人類RB的局灶性和克隆性。同移植瘤相比，RB KO模型的被敲除基因調控機制復雜且腫瘤特異性相對較低且模型動物存在一定的死亡率。

由于腫瘤的發生及其復雜，如何構建特異性更高、腫瘤的生物學特征更接近人類RB的模型，仍需進一步探索。但通過動物模型，可明確RB的組織超微結構、生物學特征、信號通路轉導以及分子之間交互作用等。此外，通過對動物模型不斷深入研究，有望提高早期診斷與早期治療的水平，亦是改善患兒視功能與延長生存期的重要臨床前手段。通過RB動物模型尋找腫瘤發生初期具有高特異性的分子靶標對于早期診斷有重要意義。