多糖對靈芝孢子油乳狀液穩定性的影響

范祺，張明，張博華，王崇隊，楊立風，孟曉峰，馬超

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250014）

關于乳狀液對生物活性成分包埋的載體構建已經有廣泛研究。將不飽和脂肪酸作為油相，既能提高乳狀液的營養價值，也能提高不飽和脂肪酸的抗氧化性[1]。蛋白穩定的水包油型乳狀液雖被廣泛用作生物活性成分的載體，但是仍具有許多缺陷，對環境非常敏感，如加熱、冷卻，尤其是對pH值和鹽濃度最敏感。這些因素都會影響乳狀液的物理和化學穩定性，造成分層、絮凝、聚集、破乳和奧斯瓦爾德熟化[2]。因此，通過制備結構更加復雜的乳狀液以提高其穩定性是擴大乳狀液應用的關鍵[3]。

蛋白質與多糖都屬于高分子聚合物，兩者之間通過離散相分離、締合相分離、共溶3種形式相互作用[4]。許多由天然多糖制備并穩定的乳狀液已經在食品工業中廣泛應用，如阿拉伯膠、玉米纖維多糖、甜菜多糖[5-7]。多糖充當乳狀液的穩定劑主要是源于其增稠作用以及空間穩定性。沒有吸附到界面的多糖會增加水相的黏度，降低分層、聚集和絮凝帶來的不穩定性。研究發現，蛋白質和多糖可以通過共價鍵或非共價鍵形成復合物，對液滴界面層的厚度、黏彈性和電荷密度等都會產生一定的影響，對乳狀液的穩定性有一定的改善作用[8]。阿拉伯膠和黃原膠是食品工業中應用廣泛的多糖[9-10]。與蛋白乳化劑不同的是，這兩種多糖在油滴表面形成厚的空間層，因此對pH值、離子強度和高溫不敏感[11]。將蛋白質和多糖復合，用這種復合體制備的乳狀液穩定性均有所提升[5]。

靈芝孢子油是采用超臨界CO2流體萃取技術，從破壁靈芝孢子中萃取，經濃縮得到的油狀脂質物，富集了靈芝孢子中的三萜類、多糖類、核苷類等活性成分，具有抗腫瘤、抑制腫瘤細胞增生及增強免疫等作用[12]。將靈芝孢子油包埋在乳狀液中，對靈芝孢子油中的活性成分具有良好的保護效果。本文以大豆分離蛋白為乳化劑，將蛋白與多糖混合，形成蛋白-多糖復合物，將靈芝孢子油作為油相包埋其中，研究多糖的加入對乳狀液穩定性和抗氧化性的改善效果，研究結果將對擴大乳狀液在食品領域的應用具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白（純度＞85%）：索萊寶試劑公司；靈芝孢子油：冠縣合作社；阿拉伯膠、黃原膠：阿拉丁試劑公司；無水乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析級）：上海生工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

AH 2100型高壓均質機：加拿大ATS有限公司；UTC高速剪切乳化均質儀：美國IKA有限公司；UV1000紫外-可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；NanoBrook Omni粒徑分析儀：美國布魯克海文儀器公司；ME104電子天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；BSC-150恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白-多糖復合乳狀液的制備

配制質量分數為2%的大豆分離蛋白母液，21℃下緩慢攪拌1 h使蛋白質充分溶解，將pH值調節至7.0后放入4℃冰箱保存待用。

稱取一定量的多糖（阿拉伯膠、黃原膠）溶于去離子水中，攪拌35 min，使其充分溶解，并用0.1 mol/L HCl或者0.1 mol/L NaOH調節pH值至7；然后將多糖溶液加入到大豆分離蛋白溶液中，攪拌35 min，使兩者充分混合，然后加入一定量的靈芝孢子油，通過高速剪切乳化均質儀以10 000 r/min的轉速剪切1 min制成粗乳液，再用高壓均質機在50 MPa、4℃條件下均質3次制備乳狀液。最終的乳狀液體系：蛋白濃度為1.0%、油的濃度為1.0%、多糖的濃度分別為0.05%、0.10%、0.20%和0.50%（均為質量分數）。所有樣品均進行3次重復制備以用于同一測定。

1.3.2 粒徑和ζ-電位的測定

采用動態光散射法（dynamic light scattering，DLS）用于大豆蛋白-靈芝孢子油乳狀液的表征。取20 μL乳狀液樣品，用緩沖液稀釋100倍。在25℃條件下，激光衍射角為173°、折射指數為1.450測定樣品的粒徑分布及ζ-電位。

1.3.3 離心穩定性的測定

在2mL離心管中準確加入2mL乳狀液，經800r/min離心10 min[13]，在距離心管底部1 cm處取樣30 μL，加入5 mL 0.1%的SDS溶液，混勻后在500 nm下測定吸光度，每個樣品重復測定3次，結果取平均值。乳狀液離心穩定性用下式計算。

式中：A0為離心前乳狀液的吸光度；At為離心后乳狀液的吸光度。

1.3.4 乳狀液儲藏試驗

將制備好的乳狀液放置于恒溫培養箱中（溫度設置25℃）儲藏10 d，測定ζ-電位和過氧化值變化。

ζ-電位測定：根據1.3.2方法測定ζ-電位。

過氧化值（peroxide value，POV）測定：不飽和脂肪酸在空氣中易與氧氣反應而酸敗，氧化過程中活性氧的含量（即過氧化值，用碘的毫克當量表示，單位為meq/kg）能夠反映油脂和脂肪酸的氧化程度。按GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準的分析方法》[14]測定過氧化值。

1.4 數據處理

所有數據用Origin 9.0軟件繪圖，采用SPSS 19.0處理軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 多糖對乳狀液粒徑分布的影響

2.1.1 阿拉伯膠對乳狀液粒徑分布的影響

圖1為靈芝孢子油乳狀液加入不同濃度阿拉伯膠后的粒徑分布圖。

圖1 不同阿拉伯膠濃度下的乳狀液粒徑分布Fig.1 Size distribution of the emulsions with different gum arabic concentrations

由圖1可知，所有粒徑均呈現雙峰分布。未加入多糖的乳狀液的兩個峰位于130nm和550nm附近，隨著阿拉伯膠濃度（0.05%～0.20%）的提高，所有粒徑分布呈現變小趨勢，當阿拉伯膠濃度為0.10%時，乳狀液的雙峰位于80nm和320nm附近。當阿拉伯膠濃度超過0.10%后，粒徑分布呈現變大趨勢，并且當阿拉伯膠濃度為0.50%時，粒徑出現了突躍，粒徑雙峰分別位于280nm和1 030 nm附近，此時多糖乳狀液穩定性有所下降。

2.1.2 黃原膠濃度對乳狀液粒徑分布的影響

圖2為黃原膠濃度對靈芝孢子油乳狀液粒徑分布的影響。

圖2 不同黃原膠濃度下的乳狀液粒徑分布Fig.2 Size distribution of the emulsions with different xanthan gum concentrations

圖2趨勢與圖1相似，當黃原膠濃度為0.05%～0.10%時，乳狀液粒徑分布隨黃原膠濃度增加呈現變小趨勢，當黃原膠濃度超過0.10%，乳狀液粒徑急劇變大，粒徑雙峰分布位于380 nm和1 400 nm附近。當黃原膠濃度為0.50%時，在2 600 nm處出現單峰分布，說明此時的乳狀液可能出現了大顆粒聚集。

由此可得，乳狀液中加入一定量的阿拉伯膠和黃原膠比單獨大豆分離蛋白構建的乳狀液粒徑分布更小且更加穩定。這可能歸結于多糖與蛋白競爭性的吸附到油-水界面，多糖中親水性的碳水化合物基團會在界面懸掛，而疏水性多肽鏈會吸附到油-水界面，導致界面層黏彈性下降，大顆粒最終形成。當阿拉伯膠低于一定濃度時，阿拉伯膠的數量不足以有效地吸附到油-水界面，但是增加了乳狀液連續相的黏度，以及阿拉伯膠的空間效應，阻止了乳狀液顆粒因重力作用所產生的沉降，提高乳狀液的穩定性。并且多糖也有一定的乳化能力，加入多糖以后，乳狀液的乳化性能提升，在均質的時候更有效地降低界面張力，促進液滴破裂，更好地覆蓋乳狀液液滴表面[15]；當加入多糖過量時，負電荷過量，失去靜電平衡，導致液滴之間排斥發生聚集，沒有被吸附的乳化劑會促進奧斯瓦爾德熟化和液滴絮凝，降低乳狀液的穩定性[16-17]。

2.2 多糖對乳狀液ζ-電位的影響

不同多糖濃度下乳狀液的ζ-電位見圖3。

圖3 不同多糖濃度下乳狀液的ζ-電位Fig.3 ζ-Potential of emulsions with different polysaccharide concentrations

乳狀液滴的電學特性常用ζ-電位來表征。對于電荷穩定的乳狀液，一般ζ-電位絕對值越大，體系越穩定[17]。另外，對于大分子穩定劑，由于空間排阻效應，粒子的ζ-電位絕對值大于20 mV時也可使粒子穩定分散于溶液中。如圖3所示，未加入多糖時，靈芝孢子油乳狀液的ζ-電位為-50.34 mV。當加入阿拉伯膠和黃原膠后，乳狀液ζ-電位的絕對值均呈現先增大后變小的趨勢。當多糖濃度為0.10%時，加入黃原膠和阿拉伯膠的乳狀液的ζ-電位為-68.65 mV和-77.65 mV。當多糖濃度超過0.10%，乳狀液ζ-電位絕對值變小，多糖濃度為0.50%時乳狀液的ζ-電位分別為-55.76 mV和-60.75 mV。大豆分離蛋白和多糖都具有一定乳化活性，能促進水包油乳狀液形成，阿拉伯膠的親水性使得復合物的表面活性得到提高，同時阿拉伯膠和黃原膠屬于酸性多糖，分子上的－COO-所帶的電荷可通過靜電排斥作用阻止油滴間聚合，提高復合物的乳化能力，使分子之間的排斥電荷增大，增強穩定性。當多糖濃度過高時負電荷過量，失去靜電平衡[18-19]。

2.3 多糖對乳狀液離心穩定性的影響

圖4為多糖濃度對乳狀液離心穩定性的影響。

圖4 多糖濃度對乳狀液離心穩定性的影響Fig.4 Effect of polysaccharide concentrations on the centrifugal stability of emulsions

由圖4可以看出，隨著多糖濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩定性呈現先上升再下降的趨勢。未加入多糖的靈芝孢子油乳狀液的離心穩定性為52.37%，加入多糖后乳狀液的離心穩定性顯著提升，其中加入阿拉伯膠的乳狀液最高可達78.76%，而黃原膠乳狀液最高則達到了86.32%。當黃原膠濃度超過0.10%，阿拉伯膠濃度超過0.20%時，乳狀液的離心穩定性略有下降，但仍高于未加多糖的乳狀液的離心穩定性。多糖乳狀液穩定性的改善主要通過增稠作用及空間穩定劑的添加，多糖通過疏水性殘基吸附到油-水界面，降低界面張力和形成空間位阻來阻止乳狀液聚集，沒有吸附到界面的多糖會增加水相的黏度，降低分層、聚集和絮凝帶來的不穩定性[20]。與阿拉伯膠相比，黃原膠的增稠作用更強，可能對乳液離心穩定性的貢獻更大。

2.4 乳狀液儲藏過程中ζ-電位的變化

表1和表2分別為阿拉伯膠和黃原膠濃度對1.0%大豆分離蛋白（靈芝孢子油濃度1.0%）的乳狀液在儲藏10 d內的ζ-電位影響。

表1 不同阿拉伯膠濃度下乳狀液儲藏過程中ζ-電位變化Table 1 ζ-Potential of emulsions with different gum arabic concentrations during storage

表2 不同黃原膠濃度下乳狀液儲藏過程中ζ-電位變化Table 2 ζ-Potential of emulsions with different xanthan gum concentrations during storage

由表1和表2可以看出，對照組在經過10 d儲藏后ζ-電位的絕對值由48.24 mV減小為25.76 mV。加入多糖后的乳狀液的ζ-電位絕對值也呈現逐漸變小的趨勢。阿拉伯膠濃度為0.50%時，儲藏10 d后，ζ-電位為-28.17 mV，黃原膠濃度為0.20%時，經過10 d儲藏后ζ-電位為-28.78 mV。阿拉伯膠和黃原膠濃度為0.05%時，10 d儲藏后ζ-電位的絕對值最大，分別為49.76 mV和40.77mV。相較于蛋白乳狀液，多糖-蛋白復合乳狀液的ζ-電位絕對值均有所增加，使分子之間的排斥電荷增大，穩定性增強。

2.5 乳狀液儲藏過程中過氧化值的變化

圖5為1.0%大豆分離蛋白（靈芝孢子油濃度1.0%）加入不同濃度阿拉伯膠后，乳狀液中POV的變化情況。

圖5 不同阿拉伯膠濃度下乳狀液過氧化值的變化Fig.5 Peroxide values of emulsions with different gum arabic concentrations

由圖5可知，未加入阿拉伯膠時，乳狀液在25℃條件下儲藏10 d，POV由第1天的0.45 meq/kg變為第10天的12.77meq/kg。加入阿拉伯膠的乳狀液，在第1天與對照組的POV相近，在第2天時，對照組的POV明顯高于蛋白-多糖復合乳狀液，第2天后差距不斷變大。0.50%濃度的阿拉伯膠乳狀液在第2天的POV為0.98 meq/kg，高于其它濃度阿拉伯膠乳狀液的POV，在第10天的POV為6.68 meq/kg，明顯低于對照組的POV，但是高于其它濃度阿拉伯膠的乳狀液。在第5天，0.05%、0.10%和0.20%阿拉伯膠乳狀液的POV相近，在第10天時，0.05%和0.10%濃度的乳狀液的POV相近，分別為4.22、4.09 meq/kg，0.20%阿拉伯膠乳狀液的POV最低，為2.35 meq/kg。

圖6為1.0%大豆分離蛋白（靈芝孢子油濃度1.0%）加入不同濃度黃原膠后，乳狀液中過氧化值的變化情況。

圖6 不同黃原膠濃度的乳狀液過氧化值的變化Fig.6 Peroxide values of emulsions with different xanthan gum concentrations

由圖6可知，在第2天時，0.50%黃原膠乳狀液的POV與對照組接近，分別為2.25 meq/kg和1.98 meq/kg。而0.05%、0.10%和0.20%濃度的黃原膠乳狀液POV接近。在第5天時黃原膠乳狀液的抗氧化作用顯現。第10天0.50%黃原膠乳狀液的POV為8.68 meq/kg。0.20%黃原膠乳狀液的POV增大到6.76 meq/kg，0.10%黃原膠乳狀液的POV最小，為5.22 meq/kg。

阿拉伯膠與黃原膠制備的乳狀液相比，可以發現在相同濃度下，阿拉伯膠乳狀液的POV低于黃原膠乳狀液。阿拉伯膠乳狀液的抗氧化性更強。0.10%黃原膠對乳狀液的抗氧化性最佳，POV為5.22 meq/kg，而阿拉伯膠濃度為0.20%時，經過10 d儲藏的乳狀液的POV僅為2.35 meq/kg。黃原膠的增稠能力雖然高于阿拉伯膠，但是阿拉伯膠具有更優良的乳化效果，阿拉伯膠的乳化能力被歸結于其中的半聚乳糖蛋白，疏水性蛋白殘基嵌入油相，親水性碳水化合物基團擴展到水相[21]。阿拉伯膠具有非常好的乳化特性，可以增強乳狀液的黏度和穩定性，經常被用來作為乳狀液的穩定劑。并且在比較寬的pH值范圍內具有良好的穩定性[22]。加入多糖以后，乳狀液的過氧化值均下降，說明蛋白-多糖復合乳狀液的抗氧化效果優于單一蛋白為乳化劑制備的乳狀液。

3 結論

本文利用大豆分離蛋白與多糖的相互作用，通過制備蛋白-多糖復合乳狀液將靈芝孢子油包埋。通過研究阿拉伯膠和黃原膠的濃度對乳狀液體系穩定性的影響，構建最佳的乳狀液包埋體系。研究發現乳狀液中加入一定量的多糖比單獨的大豆分離蛋白制備的乳狀液粒徑分布更小且更加穩定。當加入阿拉伯膠和黃原膠后，乳狀液ζ-電位的絕對值均呈現先增大后變小的趨勢。隨著多糖濃度的提升，靈芝孢子油乳狀液離心穩定性呈現先上升再下降的趨勢。與阿拉伯膠相比，黃原膠的增稠作用更強，對乳液離心穩定性的貢獻更大。相較于蛋白乳狀液，多糖-蛋白復合乳狀液在儲藏過程中的ζ-電位絕對值均有所增加，使分子之間的排斥電荷增大，穩定性增強。加入多糖后，乳狀液的過氧化值均下降，并且加入阿拉伯膠后的乳狀液的抗氧化效果優于黃原膠。當阿拉伯膠濃度為0.20%時，經過10 d儲藏后，POV最低，為2.35 meq/kg；0.10%黃原膠的抗氧化效果最好，POV最小，為5.22 meq/kg。表明大豆分離蛋白-阿拉伯膠和大豆分離蛋白-黃原膠復合體制備的乳狀液可以用于不飽和脂肪酸的包埋和保護。