超聲輔助溶劑萃取獅頭柑精油及其主要成分研究

馬學峰，茹超，劉雨晴，宋雪，魯周民

（西北農林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100）

植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物，油狀液體物質，不溶于水，易溶于有機溶劑，具有揮發性，存在于植物根、莖、葉和花果中，其主要化學成分有單萜、倍半萜烯、酯、醛、酮、醇等，有特殊氣味[1]。提取植物精油的方法主要有壓榨法[2]、水蒸氣蒸餾法[3]、有機溶劑萃取法[4-5]、超臨界CO2萃取法[6-7]等。有機溶劑萃取法是利用低沸點的有機溶劑與材料在連續提取器中加熱，低溫蒸去提取液溶劑，殘留精油[8]，具有設備簡單，精油提取率高，對有效成分有良好的選擇性等優點[9]，被廣泛應用于檸檬[10]、千層金[11]、玫瑰[12]等植物精油的提取。超聲輔助提取技術是利用超聲波的能量破除植物細胞結構，從而加速溶質溶出擴散，提高植物有效組分從固相到液相的傳質速率，實現精油的高效提取[13]。超聲波輔助提取與傳統的萃取法相比，具有萃取率高、減少耗能、處理量大、成分易于分離、凈化等優點，且操作簡單、安全性好，被用于柑橘葉[14]、丁香[15]、洋蔥[16]等植物精油的提取研究。

獅頭柑（Citrusreticulata Blanco cv.Manau Gan）屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus.L）中的柑類，為陜西安康特有經濟林果[17]。獅頭柑果面粗糙，形似獅子頭，由此而得名[18]。其果肉晶瑩剔透、汁多渣少、酸甜適度、后味微苦，具有降火明目、清熱解毒、生津止咳等多重功效[19]。近年來，有關獅頭柑研究的文獻報道逐漸增多，趙丹等[20]以獅頭柑皮為原料，研究獅頭柑皮果醬的制作方法；王杰[21]利用Box-Behnken響應面法對獅頭柑果皮和果肉的總黃酮提取工藝進行優化研究；孟瑤瑤等[22]利用Box-Behnken響應面優化獅頭柑籽油的提取工藝，并采用氣相色譜-質譜聯用法鑒定獅頭柑籽油中的脂肪酸組分；張涵[19]對獅頭柑果肉、果皮的香氣成分進行檢測，并將香氣成分與市場上常見的柑橘品種蘆柑、臍橙、砂糖桔進行了比較。但在果皮提取精油方面的研究鮮見報道，本研究以陜西安康地區的獅頭柑果皮為原料，采用超聲輔助溶劑萃取法在單因素試驗的基礎上，通過正交優化試驗，篩選獅頭柑精油的最優提取工藝參數，并對獅頭柑精油的成分進行分析，旨在為獅頭柑果皮的利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獅頭柑果皮樣品：2020年12月采摘自安康北亞熱帶經濟林果樹試驗示范站，皆為隨機采摘。選取果形飽滿、成熟度一致、無機械損傷的獅頭柑洗凈晾干后剝出其果皮作為樣品，置于-15℃冰箱內密封保存備用。

石油醚（沸程60℃～90℃）、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇、異丙醇（以上試劑均為國產分析純）：成都市科隆化學藥品有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（JJ500Y型，精度0.01）：常熟市雙杰測試儀器廠；電子分析天平（R200D型，精度0.0001）：德國Sartorious公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9140型）：上海森信實驗儀器有限公司；冰箱（BCD-215DC型）：中國海爾集團；數控超聲波清洗器（KH-500DE型）：昆山禾創超聲儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀（1310型）：美國賽默飛世爾科技有限公司；佳聲多功能粉碎機（800C）：永康市紅太陽機電有限公司；真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿有限公司；旋轉蒸發儀（RE-201D型）：上海秋佐科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取工藝流程

參照葉征美等[11]的方法萃取獅頭柑果皮精油，并稍作修改。

獅頭柑果皮樣品（鮮樣去白皮）→加液氮冷凍粉碎2 min→統一粒徑小于20目并將所有樣品混合均勻→取一定質量的樣品加有機溶劑混合→超聲輔助萃取→抽濾得提取液→50℃減壓旋蒸至冷凝器1 min內無液體滴落→稱量→計算獅頭柑精油提取率→置于4℃冰箱內密封保存。

1.3.2 提取溶劑的選擇

提取方法與選用溶劑的種類參考文獻[8，23]。取獅頭柑果皮樣品5份，每份30g，分別溶于石油醚、正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇中，在料液比 1∶5（g/mL），超聲溫度50℃，超聲功率60 W條件下超聲90 min，測定獅頭柑精油提取率。取不同溶劑提取物，滴一滴于雙圈定性濾紙上，測定擴散直徑，重復3次。

1.3.3 料液比對獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品5份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，分別以料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入不同體積的石油醚，在超聲溫度50℃，超聲功率50 W的條件下超聲120 min，測定獅頭柑精油提取率，重復3次。

1.3.4 單因素試驗

單因素試驗條件參考文獻[24]，并根據實際情況稍作修改。

1.3.4.1 不同超聲時間對獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，在超聲溫度50℃，超聲功率50 W的條件下，分別超聲30、60、90、120、150、180 min，測定獅頭柑精油提取率，重復3次。

1.3.4.2 不同超聲溫度對獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30 g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，超聲功率50W，分別在超聲溫度 30、35、40、45、50、55 ℃條件下超聲90 min，測定獅頭柑精油提取率，重復3次。

1.3.4.3 不同超聲功率對獅頭柑精油提取率的影響

取獅頭柑果皮樣品6份，每份30g，放入旋蓋廣口瓶中，以料液比1∶15（g/mL）加入石油醚，超聲溫度50℃，分別在超聲功率為 50、60、70、80、90、100 W 條件下超聲90 min，測定獅頭柑精油提取率，重復3次。

1.3.5 正交優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，在萃取溶劑為石油醚，料液比 1∶15（g/mL）的條件下，參考文獻[25]，選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率3個因素，按照表1中的因素水平，以獅頭柑精油提取率為指標，進行L9（33）正交優化試驗。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.6 精油提取率計算

式中：m1為提取精油質量，g；m2為稱取獅頭柑樣品質量，g。

1.3.7 獅頭柑精油成分測定與分析

1.3.7.1 獅頭柑精油成分測定

將萃取所得精油用正己烷將濃度稀釋為0.1%，裝入樣品瓶中供GC-MS分析使用。

色譜分析條件：TG-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始柱溫為 50 ℃，保持 1 min，以3.0℃/min升溫至130℃，保持1 min，以2℃/min升溫至150℃，保留1 min，以10℃/min升溫至280℃，保持5 min，高純氦氣作載氣，載氣為恒流模式，載體流量1.000 mL/min，進樣口溫度 250 ℃，分流比 40∶1。

質譜條件：EI（70 eV），接口和離子源的溫度分別為280℃和270℃，掃描范圍為40 aum～460 aum。

1.3.7.2 數據篩選

利用Xcalibur系統NIST 2014譜庫（美國國家標準與技術研究院2014譜庫）對質譜數據進行自動檢索對照，根據所得到的各個物質的分子式、CAS號以及分子結構確定每個化學成分并利用面積歸一化法計算各組分相對含量。

1.4 數據處理

利用Excel對數據進行分析與統計，采用Origin 2021進行制圖，使用SPSS 26.0進行單因素方差分析，數據以平均值±標準差表示，不同肩標小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。每個樣品重復測3次。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑選擇試驗結果

不同溶劑浸提精油的試驗結果見表2。

表2 不同溶劑浸提精油的結果Table 2 Results of essential oil extraction in different solvents

由表2可知，不同有機溶劑的提取效果不同，精油提取率存在明顯差異，精油性狀也有較大不同。從溶劑極性來看，無水乙醇>異丙醇>乙酸乙酯>石油醚>正己烷，獅頭柑精油的主要成分D-檸檬烯、萜品烯等屬于弱極性或中等極性物質，根據相似相溶原理，石油醚與正己烷萃取的效果較好。從結果來看，使用正己烷和石油醚作為萃取溶劑，萃取的獅頭柑精油品質較好，精油呈現澄清的金黃色，擴散性好，具有獅頭柑特有的芳香氣息。乙酸乙酯、無水乙醇、異丙醇等作為萃取溶劑時均存在不同程度的雜質，這是由于獅頭柑中的一些蠟、油脂、膠質、樹脂等成分在回流中溶解在有機溶劑中，抽濾未能完全除去。此外，使用石油醚比使用正己烷具有更低的成本。綜上所述，選取石油醚作為最優萃取溶劑。

2.2 料液比對獅頭柑精油提取率的影響

料液比對獅頭柑精油提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對獅頭柑精油提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

隨溶劑體積的增加，獅頭柑精油提取率提高，在料液比為1∶15（g/mL）時達到最大，為2.38%。這可能是增加溶劑用量時，溶劑中獅頭柑精油的濃度會降低，從而增大了獅頭柑精油與溶劑接觸界面處的濃度差，即增大了傳質推動力，提高了傳質速率[24]。之后隨著溶劑體積的不斷增加，旋蒸濃縮時間增加，造成獅頭柑精油的部分低沸點成分隨溶劑旋蒸出去，獅頭柑精油提取率下降。綜合考慮，較適宜的料液比為1∶15（g/mL）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲時間對獅頭柑精油提取率的影響

超聲時間對獅頭柑精油提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對獅頭柑精油提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖2可知，隨著超聲時間的增加，獅頭柑精油的提取率呈現上升趨勢，在90min時達到最大，為2.41%。這可能是因為隨著超聲時間的延長，會加劇細胞破碎，利于獅頭柑精油在有機溶劑中的溶出。而繼續延長超聲處理時間，獅頭柑精油的提取率基本保持不變。為確保有機溶劑盡可能地旋蒸出去，超聲處理時間選擇90 min。

2.3.2 超聲溫度對獅頭柑精油提取率的影響

超聲溫度對獅頭柑精油提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對獅頭柑精油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖3可知，獅頭柑精油提取率隨著超聲溫度的增加而增加，在50℃時達到最大，為2.42%。繼續增加溫度，提取率反而下降。這可能是因為，當溫度過高時，會導致獅頭柑精油中熱敏性物質的氧化和揮發，從而造成提取率的下降[24]。另外，升高溫度會加大能耗和成本，50℃是比較適宜的超聲溫度。

2.3.3 超聲功率對獅頭柑精油提取率的影響

超聲功率對獅頭柑精油提取率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對獅頭柑精油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

由圖4可知，獅頭柑精油提取率隨著超聲功率的增加而先增加后減少，在60 W時達到最大，為2.27%，這是由于空化作用和機械剪切作用增強，分子擴散速度增強，有利于精油的提取[26]。繼續增加功率，提取率下降，這可能是因為功率過高導致空化作用繼續增加，使獅頭柑原料停留在超聲場中的時間減少，減小了水溶劑向獅頭柑組織內滲透的幾率，導致精油得率下降[26]。另外，升高功率則會加大能耗和成本，綜合考慮，選擇超聲功率為60 W。

2.4 正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率3個因素，以精油提取率為指標，進行L9（33）正交試驗，試驗方案及結果如表3所示，影響獅頭柑果皮精油提取率各因子的方差分析見表4。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 影響獅頭柑精油提取率各因子的方差分析Table 4 Analysis of variance（ANOVA）of factors affecting the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan

從表3極差R值可以看出，獅頭柑精油提取率影響因素的大小順序為超聲溫度>超聲功率>超聲時間。由表4方差分析結果可知，超聲溫度影響差異顯著。試驗組合A3B2C2是最優組合，即超聲時間120 min，超聲溫度50℃，超聲功率60 W，經過對這一組合進行3次重復驗證試驗，提取率分別為2.44%、2.48%、2.48%，平均值為2.47%，高于正交試驗中的組合。

2.5 有機溶劑萃取法提取獅頭柑精油的成分分析

對提取的精油進行成分分離與鑒定，總離子流色譜圖如圖5所示。所得質譜圖經數據庫檢索對照、根據相似度指數（similarity index，SI）和反相相似度指數（reverse similarity index，RSI）值，人工圖譜分析和可靠性篩選[27-28]后，初步確認了19種化學成分，分析結果如表5所示。

圖5 獅頭柑精油成分總離子流色譜圖Fig.5 Total ion flow chromatogram of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil components

表5 獅頭柑精油GC-MS分析結果Table 5 GC-MS analysis of Citrus reticulata Blanco cv.Manau Gan essential oil

從超聲輔助溶劑提取法制得的獅頭柑精油中共鑒定出19種相對百分含量較多的目標組分，其中幾乎均為單萜類及其氧化物，占氣相出峰總萃取物的96.67%。其中屬于單萜烯類化合物7種，總含量為96.22%，它們分別是α-蒎烯、左旋-β-蒎烯、α-月桂烯、D-檸檬烯、羅勒烯、萜品烯、α-異松油烯；屬于單萜醇類化合物2種，總含量為0.38%，它們分別是芳樟醇、松油醇；屬于單萜醛類化合物只有1種，為香茅醛，含量為0.07%。

這些被鑒定出的化學組分多是各種食品添加劑、香料等的有效組分，同時在其他柑橘精油中可見分布，但含量有所差異。從超聲波輔助溶劑提取法制得的精油中相對含量最高的物質是D-檸檬烯，占氣相出峰總萃取物的91.23%，但在對柑橘精油的相關研究中可知，D-檸檬烯對柑橘精油香味的貢獻很小，而其他萜烯類、醇類、醛類和酯類相對含量雖然很低，但它們卻是果實香味主要來源[29]。

3 結論

超聲輔助溶劑萃取獅頭柑精油的適宜溶劑為石油醚、適宜料液比為1∶15（g/mL），在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對3個因素進行優化，優化結果為超聲溫度50℃，超聲功率60 W條件下超聲120 min，獅頭柑精油的提取率為2.47%。氣相色譜-質譜分析表明，獅頭柑精油中共鑒定出19種化學成分，分別含有烯、醇、酯、醛、芳香、烷烴類等化合物，其中D-檸檬烯為主成分，間二甲苯、α-蒎烯、α-月桂烯、萜品烯、芳樟醇相對含量較高，這些物質的共同作用形成了獅頭柑精油特有的香味。