短期奧氮平給藥改變大鼠肝臟脂代謝：量效關系研究

岳 琴， 毛文星， 張浩天， 胡昌華， 劉雪梅

西南大學 藥學院，重慶 400715

奧氮平(Olanzapine，Ola)是二代抗精神病藥物的典型代表，但長期使用容易導致患者體質量增加、肥胖及其他代謝性疾病，如高脂血癥、2型糖尿病等；Ola誘發的脂代謝紊亂因控制不理想、且缺乏相應的預防措施致使心腦血管并發癥和早逝風險大為增加[1-4]．現階段，Ola介導代謝副反應的具體機制尚未明確，各研究團隊以嚙齒動物為模型，選擇0.5～6 mg/kg等劑量，探究了這類藥物介導代謝副反應的相關機制[5-9]．但因實驗設計中，給藥方式、劑量、作用時間等差異大，研究結論仍存在諸多不一致．

本研究旨在模擬臨床口服給藥方式，探究臨床用藥劑量范圍內，藥物劑量與代謝副反應之間的關聯，并進一步解析Ola介導脂代謝紊亂的可能機制，以期為合理建立動物實驗模型及解決臨床問題提供一定的指導．

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級健康雌性成年SD大鼠50只，8周齡，體質量180～220 g，來自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，實驗動物生產許可證：SCXK(渝)2007-0006．大鼠每籠2只，于室溫22 ℃，相對濕度(50±5)%且模擬晝夜規律(7：00～19：00 開啟照明)的環境下飼養；適應環境3 d后，訓練主動口服糖丸3 d(主動口服給藥)．所有動物實驗經學院實驗動物倫理委員會批準實施．

1.2 藥 品

Ola，美國Lilly藥業公司，C17H20N4S，CAS號：132539-06-1．按比例將玉米淀粉(47.3%)、蔗糖(30.9%)、明膠(6.3%)和干酪素(15.5%)混合均勻后制成空白糖丸；將剝去包衣的Ola片劑用研缽磨成粉，按不同藥物濃度稱取相應質量的粉末加入到空白糖丸干粉混合物中制成含藥糖丸，4 ℃避光儲存．以2.0 mg/kg劑量組(總質量2.5 kg)每天給藥糖丸制作為例：取1片奧氮平片(有效量為5mg)去除包衣研磨成細粉后，加入按比例混合均勻的空白糖丸干粉15 g，再次充分混勻后加水制成軟糯的糖丸，并按照每只大鼠對應體質量占比稱取相應質量的糖丸，將其均分為3份．

1.3 主要試劑

油紅O，北京鼎國昌盛生物公司(DH222-1)；總RNA快速提取試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司(RP1202)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊(Q321-02)；HiScript III RT SuperMix for qPCR，南京諾唯贊(R323-01)；所有血清生化指標檢測試劑均購自北京鼎國昌盛生物公司；抗體SREBP1，Bioss bs-1402R；OCTN2，ABclonal (A1676)；CPT1A，ABclonal (A5307)；PPARα，Wanleibio (WL00978)；GAPDH(胞漿內參蛋白)，Servicebio (GB11002)．

1.4 主要儀器

生化分析儀，Olympus AU400 chemistry analyser，Japan；冰凍切片機，德國萊卡公司(CM1900)；酶標儀，Bio-Rad (Model 680)；實時熒光定量PCR儀，Bio-Rad；PCR儀，Bio-Rad；熒光及化學發光成像系統，上海勤翔(ChemiScope 6000 Pro)．

2 方 法

2.1 藥物處理

將大鼠隨機分為5組，適應環境及口服糖丸訓練結束后，分別給0，0.25，0.5，1.0，2.0 mg/kg的含藥糖丸，每天3次，每次間隔8 h，連續給藥14 d．飼養及給藥期間，每天記錄大鼠的體質量、攝食和飲水情況．藥物處理第14 d，所有動物禁食12 h后(過夜)，經二氧化碳窒息處死，心臟采血，并分別測量大鼠的腎周脂肪、卵巢周圍脂肪、腹股溝脂肪、總腹部脂肪和總白色脂肪的質量[10]．

2.2 生化分析

心臟采血，將含有促凝劑的全血放入37 ℃水浴30 min，1 200 r/min離心10 min，留上清并保存至-20 ℃冰箱；檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等參數；檢測10%肝臟勻漿中游離脂肪酸(FFA)量．

2.3 組織油紅O(ORO)染色及蘇木精伊紅(HE)染色

利用冰凍切片機獲取12 μm厚度的肝臟組織切片，復溫15 min，用油紅O染色10 min，流水沖洗去除多余的油紅O染液，最后用蘇木素染核10 s；腹部白色脂肪經石蠟包埋切片后獲得4 μm的組織切片，采用常規HE染色方法進行染色；染色結果于顯微鏡下觀察并拍照，相應指標用Image Pro Plus(IPP)進行統計．

2.4 細胞免疫熒光

采用H-DMEM(含10%胎牛血清)培養HepG2細胞至密度為80%～90%，鋪板過夜后由Ola(0，2.5，5，10 μmol/L)處理24 h．磷酸緩沖液(PBS)清洗，用4%多聚甲醛固定細胞15 min；用含0.5%Triton X-100的PBS室溫通透細胞20 min，再用1% BSA封閉1 h；經4 ℃一抗(1∶50)孵育過夜，37 ℃避光孵育二抗(CY3)1 h；DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚) 孵育5 min，熒光顯微鏡下觀察拍照，合并后得到MERGE圖像．

2.5 總RNA提取及RT-PCR檢測

按試劑盒方法提取肝臟總RNA，取1 μg RNA逆轉錄得到cDNA，用SYBR進行熒光定量．每個樣本做3個平行，以Gapdh和Rpl13a為內參基因，以 2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量．

2.6 蛋白提取及Western blot檢測

肝臟組織加入蛋白裂解液后(含PMSF)在均質破碎儀上勻漿，冰上裂解30 min，離心取上清，用BCA法測蛋白濃度．蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離，轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗1 h，ECL化學發光顯影，Quantity One統計灰度值[11]，每個樣本重復2次實驗，GAPDH為胞漿內參蛋白，H3為核內參蛋白．

2.7 數據處理和統計分析

采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，Kolmogorov-Smirnov test檢測所有數據分布；組間比較采用單因素方差分析，所有數據用x±s表示，p<0.05表示差異有統計學意義．

3 實驗結果

3.1 奧氮平給藥影響大鼠體質量及脂肪生成

Ola處理2周后，給藥組體質量累積增量均高于對照組，其中1.0和2.0 mg/kg劑量組體質量增加明顯(p<0.01和p<0.05)；攝食、飲水未見明顯改變．此外，對各劑量組的脂肪組織質量進行評估發現：1.0 mg/kg劑量組大鼠總腹部脂肪、卵巢周圍脂肪以及總白色脂肪顯著增加(p<0.05)；2.0 mg/kg劑量組大鼠總白色脂肪顯著增加(p<0.05)(圖1)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統計學意義．

3.2 奧氮平給藥影響大鼠脂質代謝

藥物處理2周后，大鼠肝臟游離脂肪酸(FFA)量隨給藥劑量遞增呈上升趨勢，其中1.0和2.0 mg/kg劑量組FFA增加與對照組相比差異有統計學意義；1.0和2.0 mg/kg劑量組大鼠血清TG水平增加與對照組相比差異有統計學意義(p<0.01)；各劑量組TC水平與對照組相比，差異均有統計學意義．對肝臟進行切片油紅O染色，給藥2周后，1.0和2.0 mg/kg劑量組脂滴面積顯著高于對照組．腹部白色脂肪切片HE染色結果顯示，1.0和2.0 mg/kg劑量組脂肪細胞直徑顯著高于對照組(圖2)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，差異有統計學意義．

3.3 奧氮平上調大鼠脂肪酸合成相關因子

脂質的堆積可能是由于脂肪合成增多，肝臟是脂代謝的重要場所，因此需要對肝臟中脂肪合成相關因子進行探究(圖3)．實時熒光定量PCR實驗結果表明：在給藥2周后，與對照組相比，脂肪合成相關因子Srebp1，Scd1，Fasn和Acc1 mRNA水平顯著上調，不同給藥劑量上調程度有所不同；總蛋白中SREBP1蛋白表達水平與對照相比變化無統計學意義，藥物干預后胞質蛋白中SREBP1蛋白表達水平下降，核蛋白中的SREBP1顯著增加(p<0.001)，肝細胞免疫熒光結果也顯示細胞核中的SREBP1表達水平隨Ola劑量增加而增加．

3.4 奧氮平下調大鼠脂肪酸氧化相關因子

檢測Ola對肝臟中脂肪酸氧化相關因子的影響(圖4)，結果顯示：Ola給藥2周后，0.5，1.0和2.0 mg/kg劑量組肝臟中脂肪酸氧化相關因子CPT1A和總蛋白中PPARα顯著下調，同時核蛋白中PPARα也顯著下調，且隨Ola劑量增加下調程度增大，胞質蛋白中PPARα變化無統計學意義；細胞免疫熒光實驗結果顯示細胞核中PPARα劑量下調；OCTN2也出現了下調的結果，其中2.0 mg/kg劑量組變化有統計學意義(p<0.05)．

*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，差異有統計學意義．

4 討 論

根據《精神分裂癥防治指南》(2版)，本實驗模擬臨床上急性期患者診療方案，設計了0.25，0.5，1.0和2.0 mg/kg奧氮平4個劑量組(等同于臨床每60 kg用藥5～20 mg)每14 d的藥物處理實驗．實驗結果顯示，在臨床劑量范圍內，Ola劑量與脂代謝副反應程度之間相關聯，不同劑量Ola會介導不同程度的代謝副反應．1.0 mg/kg和2.0 mg/kg(等同于臨床常用的每60 kg用藥10 mg和20 mg)劑量組的各項檢測指標最為顯著．因此，在這類藥物的使用過程中，臨床監測是非常必要的．

實驗過程中，為了盡量減少大鼠因灌胃、注射等給藥方式而產生的應激反應，我們采用了主動口服給藥，使之更接近臨床病人用藥的方式[12-13]．此外，在藥物作用時間上，因臨床研究發現，抗精神病藥導致體質量增加及糖脂代謝變化不同于單純性肥胖，其糖脂代謝有其自身的特點，尤其在治療干預前2～4周，體型指標及血脂指標出現顯著變化[14-15]．因此，本研究選擇了14 d的給藥時間，等同于臨床4～6周治療時間．結果發現，藥物處理14 d后，動物出現顯著的體質量增加和脂代謝變化，尤其是1.0 mg/kg和2.0 mg/kg劑量組．因此，我們認為SD大鼠能較好地模擬藥源性代謝紊亂，這為進一步分子機制的探析提供了穩定的動物模型．

SREBP1是調節肝臟脂代謝的關鍵因子[16-17]，與脂肪合成密切相關[18-20]，本實驗結果表明，Ola通過增加肝臟中SREBP1入核，激活下游脂肪合成相關靶基因Fasn，Acc1和Scd1的轉錄，增加脂質合成．PPARα，CPT1A，OCTN2與肝臟脂肪酸氧化相關[20-24]，CPT1A是脂肪酸β氧化的限速酶；OCTN2作為最主要的肉堿轉運蛋白[21]，負責肉堿的攝取轉運，也是脂肪酸β氧化的關鍵因子，已經發現補充肉堿可以在一定程度上減輕抗精神分裂癥藥介導的肝臟脂質積聚[22]，進一步說明OCTN2在抗精神分裂癥藥介導的脂代謝紊亂中的關鍵作用；PPARα是脂肪分解過程中的關鍵轉錄調控因子，參與CPT1A和OCTN2的轉錄調控[25-26]．我們發現奧氮平通過減少PPARα的入核，下調下游脂肪酸氧化關鍵因子CPT1A和OCTN2的蛋白表達，抑制脂肪酸的β氧化，脂質分解減弱．Ola介導的脂質代謝紊亂是脂質合成增多及分解減小共同作用的結果．

5 結 論

實驗結果顯示：2周Ola給藥處理后，SD大鼠出現脂質代謝紊亂，該效應與Ola劑量存在顯著相關，尤其是臨床常用劑量(1.0 mg/kg和2.0 mg/kg)存在較大的誘發脂代謝紊亂的風險．該副反應可能與Ola上調脂肪合成因子SREBP1及其下游靶標基因Fasn，Acc1，Scd1和下調脂肪酸氧化相關因子PPARα，CPT1A和OCTN2有關(圖5)．

圖5 奧氮平介導肝臟脂代謝紊亂的可能通路