超量表達DWF4基因對芥菜生長發育的影響

蘭彩耘， 宋洪元

1. 重慶市江津區現代農業園區發展中心，重慶 江津 402260；2. 西南大學 園藝園林學院，重慶 400715

BR缺陷突變體如擬南芥中的DET2，DWARF4(DWF4)和CPD，番茄中的DWARF，豆科植物中的LKB；BR不敏感突變體如擬南芥中的DWF12，BRI1，BIN2，BAK1，豆科植物中的LKA，番茄中的CURL-3等都不同程度表現為根長、株高、花序、角果、葉柄、胚軸的減短、頂端優勢的減弱、育性衰減、開花和葉片卷曲、維管束和光形態建成上的變化，顯示BR在植株生長和發育中的重要作用[1]．通過在植株中超表達DWF4基因，可以使植株更高，葉片更多[2]．目前還發現BR和其他激素在側根發生方面起到的協同作用[3]，然而對于下胚軸和根的向地性方面起到的卻是反作用．低濃度水平下的BR促進根的伸長，高濃度則抑制根的伸長[3]．多種實驗結果證明BR能促進產量提高．水稻BR缺陷突變體BRD2致使谷物顆粒變短而且縮小，而DWF11突變體也呈現出種子減少現象[4]．相反，超表達BR生物合成基因將增大水稻顆粒，增加水稻產量，轉基因水稻與野生型相比，分蘗數更多[5]．在擬南芥中，BR對種子發育有決定性作用，包括種子大小、種子形狀和種子數量等[6]．擬南芥BR缺陷突變體DWF5結出的種子變小[7]，BR缺陷突變體DET2和BRI1-5的種子也都比野生型小，而且DET2 和BRI1-5的種子質量比野生型分別輕17%和10%，BZR1功能獲得型突變體BZR1-1D的種子與野生型相比，不僅更小而且變得更輕[6]．在擬南芥中，超表達DWF4可以提高種子數量．就如Choe等[2]研究過表達BR合成關鍵基因，獲得了轉基因擬南芥植株，對該轉基因植株的果莢和分枝數統計調查顯示其數量均增加2倍，種子產量增加了59%，GC-MS分析表明該轉基因植株內源BR水平確實有所升高．另外，BR還調節植物花期和衰老．BR相關基因CPD，可以通過光周期途徑調節開花，而CPD同系物GmCPDs促成開花發育，調控花期[8]．水稻BR信號途徑相關基因SDG725，也和花期調控相關[9]．

目前，在BR的生物合成、代謝作用、信號轉導途徑中都有很多報道，其中DWF4編碼細胞色素P450酶，與CPD基因處于同一家族不同亞族[10]．DWF4的mRNA水平因外源施加油菜素內酯(brassinolide，BL)而大幅下降，因施加BRZ(油菜素內酯抑制劑)而大幅提高，證實DWF4在BR平衡調節上起到了重要的作用[11]．DWF4敲除突變體的內源BRs缺失將致使植株矮小，突變體植株細胞伸長受到限制[12]．對野生型植株施加BRZ，將抑制或結合DWF4酶[13]，也會造成內源BRs缺失致使植株矮小．DWF4是維持BR平衡的關鍵基因，因其可以迅速而準確地對內源BR水平響應表達變化[14]．本實驗中通過農桿菌介導轉化法將DWF4基因導入芥菜中，研究DWF4基因在芥菜生長過程中的作用與功能，為解析DWF4基因參與BR信號傳導的機制提供直接或者間接的實驗證據，也為今后開發生物技術手段調控植物生長發育奠定理論基礎．

1 材料與方法

1.1 材 料

含pCABarDWF4植物表達載體質粒的農桿菌由西南大學蔬菜學實驗室提供，表達載體結構示意圖見圖1．

圖1 pCABarDWF4植物表達載體結構結構圖

1.2 芥菜遺傳轉化

利用農桿菌介導法轉化芥菜，芥菜種子所需消毒時間為75%的乙醇消毒1 min，0.1%的升汞處理8 min，所需農桿菌侵染時間為8 min，使用的預培養基成分為MS+2 mg/L 6-BA(6-芐基腺嘌呤)+0.2 mg/L NAA(萘乙酸)；篩選培養基成分為MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT(膦絲菌素)+400 mg/L Carb(羧芐青霉素)；生根培養基成分為MS+0.2 mg/L NAA+8 mg/L PPT+400 mg/L Carb．

1.3 轉基因芥菜植株的PCR鑒定

采用CTAB法提取獲得的轉基因芥菜植株基因組DNA進行PCR擴增．引物DWF4-1和DWF4-2用于pCABarDWF4轉基因芥菜植株DWF4基因片段的檢測．PCR擴增參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 40 s；56 ℃ 40 s；72 ℃延伸2 min；30個循環；72 ℃延伸10 min．獲得的擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測．

1.4 pCABarDWF4轉基因芥菜植株DWF4基因、BR生物合成結構基因、轉錄調控基因的表達分析

用TIANGEN RNA prep pure Plant Kit提取試劑盒提取pCABarDWF4轉基因芥菜植株總RNA，根據TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa)試劑盒說明書進行cDNA合成，獲得的第一鏈cDNA稀釋5倍后作為RT-PCR模板．以芥菜BjActin為內參，對轉基因植株和非轉基因植株中的DWF4基因BR生物合成結構基因的表達情況進行Real Time RT-PCR分析，反應在C1000/CFX96 儀器(Bio-Rad，美國)上完成，具體操作按照SYBR?Premix Ex TaqTMII說明書進行．利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀CFX Manager Software 軟件(2-ΔΔCT法)和Microsoft Excel軟件分析數據．

1.5 pCABarDWF4轉基因芥菜植株形態分析

pCABarDWF4轉基因芥菜植株及非轉基因植株種子播種于培養皿中，鋪上濾紙，只施加蒸餾水，置于25 ℃培養室中，光照條件和黑暗條件下培養4 d，每個基因型進行3次重復，每個重復20粒種子，最后調查其根長、下胚軸長、總長，在濾紙上吸干水后測其鮮質量，最后置于60 ℃烘箱中烘干測其干質量．pCABarDWF4轉基因芥菜植株及非轉基因植株播種于培養盆中，播種后每隔15 d測量其株高、開展度、單株最大葉長和最大葉寬，自花授粉結束后測量主枝長度、主枝果莢數、主枝種子數、一次分枝數、一次分枝果莢數、一次分枝種子數、二次分枝數、二次分枝果莢數、二次分枝種子數并測量千粒質量和籽粒密度．千粒質量的測定：轉基因植株和野生型植株種子分別取100粒稱質量，3次重復，取其平均值．籽粒密度(D)的測定：取200粒稱質量記為M，然后將籽粒放入事先盛有定量體積V1酒精的量筒中，然后讀取體積V2，則籽粒體積V=V2-V1．籽粒密度D=M/V，單位g/mL，3次重復．

2 結果與分析

2.1 pCABarDWF4轉基因芥菜植株的獲得及鑒定

PCABarDWF4表達載體通過農桿菌介導的下胚軸轉化，侵染后的下胚軸轉接至含8 mg/L PPT和400 mg/L Carb的抑菌篩選培養基上，對獲得的不定芽進行多代篩選，淘汰未轉化的白化芽和嵌合體，獲得多個具PPT抗性的綠色愈傷組織和芽(圖2a和圖2b)，抗性芽接種至生根培養基上進行生根培養(圖2c)．抗性植株煉苗后，移栽至泥炭土營養缽中(圖2d)，最后定植于大田中，正常管理至植株開花．提取pCABarDWF4轉基因芥菜植株T0代基因組DNA從3株轉基因植株中擴增到預期大小300 bp左右的目的片段(圖2e)．

M為DNA相對分子質量標準；D1，D2和D3為野生型植株；WT為野生型植株；CK+為陽性對照(質粒)；CK-為陰性對照(未加入DNA)．

2.2 pCABarDWF4轉基因芥菜植株DWF4基因的表達分析

提取pCABarDWF4轉基因芥菜植株的RNA，以芥菜BjActin為內參進行DWF4基因的定量表達分析．從結果(圖3)可以看出，pCABarDWF4轉基因芥菜D1，D2和D3植株中，DWF4基因均有不同程度的表達，但表達量在植株之間有差異，D2和D3植株中目的基因表達量較高，對照野生型植株(WT)未檢測到明顯的DWF4表達．

D1，D2和D3為轉基因植株，WT為野生型植株；小寫字母不同表示p<0.05，差異有統計學意義．

2.3 pCABarDWF4轉基因芥菜植株苗期光暗處理表現分析

將pCABarDWF4轉基因芥菜種子進行光照處理后調查其生長狀況．從表1可以看出，D2和D3的根長顯著高于野生型，D1的根長雖然高于野生型但未達到統計學意義．D1和D3的下胚軸長顯著高于野生型．D1，D2和D3苗期總長均顯著高于野生型．在鮮質量方面，轉基因植株以及野生型植株之間差異無統計學意義．在干質量方面，D1和D3顯著高于野生型，D2的干質量雖然高于野生型但差異無統計學意義．相比之下，苗期生長最為旺盛的是D3．綜上所述，在光照條件下，在芥菜中超表達DWF4基因能一定程度上促進苗期生長．

表1 pCABarDWF4轉基因芥菜植株T2代光照下苗期調查

與光照條件下相比，在黑暗中，不管是轉基因植株還是野生型植株，苗期下胚軸都大幅度伸長，但植株纖弱，子葉黃化．從表2中可以看出，D2和D3的根長顯著高于野生型，D1的根長雖然高于野生型但差異無統計學意義．D1和D3苗期下胚軸長均顯著高于野生型，D2下胚軸長低于野生型．在苗期總長上，D1和D3顯著高于野生型，由于D2下胚長較短的原因，所以其總長與野生型差異無統計學意義．在鮮質量和干質量上，轉基因植株與野生型植株之間差異無統計學意義．從實驗結果可以看出，在黑暗條件下，DWF4基因能在一定程度上促進苗期根和下胚軸伸長．

表2 pCABarDWF4轉基因芥菜植株T2代黑暗處理下苗期調查

光照條件與黑暗條件下不同的是，光照條件下苗期干質量差異有統計學意義．不論是置于光照還是黑暗條件下，D3生長都是最為旺盛的，苗期總長和下胚軸長都顯著高于野生型．通過對轉基因植株苗期光照和黑暗條件下生長情況的統計，可以發現轉基因植株根和下胚軸長一定程度上都高于野生型植株，而且D3表現最好．結合D3轉基因株系DWF4基因較高的表達水平，顯示DWF4基因表達較高者，其苗期根以及下胚軸生長速度會更快．

2.4 pCABarDWF4轉基因芥菜植株生長情況分析

將pCABarDWF4轉基因芥菜植株置于人工氣候室內培養觀察，從其整個生命周期中，轉基因植株比野生型植株生長更加旺盛．在60 d時，轉基因植株就已經比野生型植株長得更壯，其葉片伸展更開(圖4a)．

到180 d時，轉基因植株開始逐漸抽薹，而野生型植株還沒有抽薹(圖4c)．轉基因植株最早開花時間比野生型植株提前一個多月．轉基因植株和野生型植株花器官相比，轉基因植株的花瓣較大(圖4d)．對比轉基因植株和野生型植株同時期的葉片，可以發現轉基因植株葉片伸展更長、更寬，而且葉片顏色更加濃綠(圖4b)．從圖5中可以發現，隨著時間的延長，轉基因植株和野生型植株的株高、開展度、最大葉長和最大葉寬也隨著增長，但是轉基因植株生長明顯快于野生型植株．轉基因植株之間相比，D2和D3生長勢明顯好于D1．

圖4 T2代pCABarDWF4轉基因芥菜植株的形態學比較

D1，D2和D3為轉基因植株，WT為野生型植株．

2.5 pCABarDWF4轉基因芥菜植株結籽情況分析

進一步對轉基因植株結莢結籽情況進行了調查．轉基因植株枝條上比野生型植株結有更多的種子(圖6a)，轉基因植株果莢長度高于野生型植株果莢長度(圖6b)，且轉基因植株果莢結籽數更多(圖6c和圖6d)．

圖6 T2代pCABarDWF4轉基因芥菜植株結籽情況

從表3中可以看出，轉基因植株主枝長度遠遠超過野生型植株．除D3外，主枝平均果莢數也超過了野生型，轉基因植株主枝果莢長度和所結種子數均高于野生型．轉基因植株一次分枝數和二次分枝數高于野生型，且一次分枝果莢數、一次分枝所結種子數和二次分枝果莢數、二次分枝所結種子數也都高于野生型．綜合來看，轉基因植株種莢率、全株總種莢數和所結總種子數均高于野生型植株．對千粒質量和籽粒密度測量數據來看，D1和D2超過野生型而D3與野生型基本一致．結果顯示，在芥菜中超表達DWF4基因具有明顯增加種子產量的作用．

表3 pCABarDWF4轉基因芥菜T2代結種數調查統計

續表3

2.6 pCABarDWF4轉基因芥菜植株BR生物合成結構基因

DET2，ROT3，CPD，CYP85A2等基因被認為參與了BR的生物合成．在pCABarDWF4轉基因植株中，DWF4下游基因DET2在D2和D3株系中平均表達量是野生型的2倍，說明超表達DWF4基因促進了下游DET2基因的表達(圖7a)．

DET2基因下游的ROT3基因在轉基因植株中的平均表達量高出野生型植株的40%(圖7b)．

CPD基因代謝油菜甾醇(campesterol)和其他中間產物，而DWF4基因也參與代謝油菜甾醇，DWF4基因與CPD基因可能存在競爭作用．在本實驗中，pCABarDWF4轉基因芥菜植株的CPD基因表達量都低于野生型，其平均表達量只達到野生型植株表達量的一半，說明DWF4基因與CPD基因表達呈負相關(圖7c)．

D1，D2和D3為轉基因植株，WT為野生型植株；小寫字母不同表示p<0.05，差異有統計學意義．

CYP85A2是BR生物合成途徑中的重要因子，在pCABarDWF4轉基因芥菜植株中，他們的相對表達量都不同程度高于野生型，CYP85A2是在BR合成途徑中最后一步反應的基因，說明轉基因pCABarDWF4芥菜中，超表達DWF4基因促進了下游相關BR合成基因的表達，促進了BR的生物合成．

2.7 pCABarDWF4轉基因芥菜植株BR轉錄調控相關基因表達分析

BR生物合成除了結構基因的表達外，還受到細胞內其他轉錄激活或者轉錄抑制基因的調控．

BAK1是一類重要的類受體蛋白，參與調控BR的合成，調節植物生長發育．在pCABarDWF4轉基因植株中，BAK1基因表達量均比野生型植株表達量升高，且平均值高出近40%(圖8a)．

BAS1基因表達被外源BR誘導，功能應該是維系內源BR的恒定水平，其羥化C26，影響植株體內BR量，是一個油菜素內酯失活基因．在本研究中，雖然轉基因植株中BAS1的平均表達量0.95高于野生型植株表達量0.83，但隨著DWF4基因表達水平上升，BAS1基因表達水平降低(圖8b)．

D1，D2，D3為轉基因植株，WT為野生型植株；小寫字母不同表示p<0.05，差異有統計學意義．

BES1和BZR1是油菜素甾醇信號途徑下游最重要的一類轉錄因子，參與油菜素甾醇合成轉錄的誘導和抑制調控．在本研究中，轉基因株系中BES1和BZR1的平均表達量分別是野生型植株的2～3倍(圖8c和圖8d)，說明超表達DWF4基因導致細胞內BR積累水平上升后，引起BES1和BZR1基因表達水平上升，促進細胞內積累更多的BR．

BIN2在BR途徑中起到調控BES1和BZR1的作用，在轉基因植株中BIN2基因的平均表達量是野生型植株的2倍(圖8e)，BES1和BZR1表達量較高，那么BIN2表達量應和這兩個基因表達量相一致．

BSKs是一類參與油菜素內酯信號轉導的植物特異受體類胞質激酶，參與BR信號轉導途徑，在轉基因植株中其平均表達量高于野生型植株近50%(圖8f)．

BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs都參與了BR合成的轉錄調控，調節內源BR水平，在pCABarDWF4轉基因芥菜植株中，隨著DWF4基因表達水平的提高，大多數調控基因BAK1，BZR1，BIN2和BSKs的表達量與DWF4表達量呈正相關，出現明顯上調．而維系細胞內內源BR穩定水平的BAS1基因，則在不同植株之間的表達水平變化小．

3 討 論

3.1 DWF4基因超表達對芥菜生長發育的影響

DWF4編碼C22羥基化酶，其轉錄水平受BR反饋抑制，其可以迅速而準確地對內源BR水平響應表達變化[11，14]，是BR合成關鍵基因之一．在擬南芥中，不論是光照還是黑暗條件下，通過超表達DWF4基因，擬南芥幼苗下胚軸長度遠遠高于對照野生型[2]，本實驗中，在芥菜中超量表達DWF4基因后，與野生型相比，轉基因苗期根莖伸長變快，與在擬南芥中的實驗結果一致．在擬南芥和煙草中超表達DWF4基因，其成熟植株花序高度分別增加了35%和14%，與野生型相比，在擬南芥中超表達DWF4基因將增加近兩倍的分枝數和結莢數，結子量升高[2]．而在本實驗中，通過在芥菜中超表達DWF4基因，轉基因芥菜所結種子數是野生型的近2.5倍，說明超表達DWF4基因可以大幅度促進植株產量提高．在擬南芥中超表達DWF4基因將使植株葉片葉柄伸長，開花時間提前，轉基因植株生長更加旺盛[15]．在本文圖4和圖5中可以看出，芥菜超表達DWF4基因使植株株高、開展度、最大葉長和最大葉寬皆比同時期野生型增高，轉基因植株抽薹開花時間提前．說明DWF4基因對植株生長發育有促進作用，因此增強了植株生長勢，植株生長更加旺盛可能也與轉基因植株產量提高息息相關．

3.2 DWF4基因超表達對BR合成調控途徑相關基因表達的影響

DWF1誘導24-亞甲基膽甾醇(24-methylenecholesterol)轉變為蕓薹甾醇(Campesterol)[16]，是BR前期合成的重要基因．在本文中，超表達DWF4基因并沒有太多影響DWF1基因的表達，可能是DWF1作用與DWF4基因上游有關．DET2，5-α還原酶被認為是油菜素內酯生物合成酶關鍵元件，其催化菜油甾醇轉化為菜油甾烷醇，是油菜素內酯合成過程中催化較早反應的酶[17]．在本實驗中，超表達DWF4基因促進了DET2的表達，特別是D2和D3植株，表達量超出了野生型植株約2倍，說明DWF4基因正調控DET2的表達．ROT3編碼細胞色素P450(CYP90C1)，在葉和花的形成發展期間，與細胞極性伸長相關[18]，在BR生物合成途徑中，ROT3與CYP90D1起著共同催化C23羥基化的作用[19]．在本實驗中，ROT3表達量在轉基因植株中表達較高，遠遠超過野生型植株，說明超量表達DWF4基因促進了ROT3基因的表達．有報道稱CPD基因編碼一種重要的BR合成酶(CYP90A1)，催化C23羥化反應，代謝油菜甾醇(campesterol)和其他中間產物，Ohnishi等[20]則發現CPD基因參與C3氧化反應．在本實驗中，超表達DWF4基因使得CPD表達量降低，說明DWF4負調節CPD基因，這可能是DWF4基因和CPD基因具有相似性，在BR合成途徑中作用位點有相同之處，因此兩者產生了抑制作用．CYP85A2調節內源CS水平從而控制BR中C28和C27生物合成途徑，在C6氧化途徑中，CYP85A2比CYP85A1更加有活性，通過超表達和對兩個基因突變體的觀察研究也證實了此結論．在擬南芥中，CYP85A1對CYP85A2起到輔助作用促進BR合成[21]，在本實驗中，超表達DWF4基因促進了CYP85A1和CYP85A2的表達，而且CYP85A2基因表達量升高更多，佐證了CYP85A2基因比CYP85A1基因活性更強、作用更強的結論，而CYP85A2基因是BR生物合成途徑中最后一步反應的重要因子，因此CYP85A2基因表達量的升高證實轉基因植株體內BR濃度水平的升高．所以，超表達DWF4基因促進了植株體內BR合成途徑中的相關基因，促進了內源BR的生成．

BAK1編碼一個由615個氨基酸組成的蛋白，是一個典型的受體激酶，其在植物體內廣泛表達，參與調控BR信號[22]，在芥菜中超表達DWF4基因促進了BAK1的表達．BAS1編碼一種C26羥化酶，催化CS和BL分別生成26-OH-CS和26-OH-BL，從而使BL功能失活，以維持體內活性BL的靜態平衡，在內源BL含量高的組織器官中活躍表達[23]．但是在本實驗中，超表達DWF4基因并沒有顯著提高BAS1的表達量，其中的內在機理還需進一步研究．核內蛋白BZR1和其同系物BES1是BR信號途徑中的兩個重要轉錄因子，被PP2A蛋白介導脫去磷酸化，去磷酸化后的BZR1和BES1在細胞核中調節將近1 000個靶基因，從而調節植物生長．ChIP-qPCR實驗顯示BZR1和BES1可以結合DWF4基因和BR誘導基因SAUR-AC1[24]．在本文中，BES1和BZR1兩個基因在轉基因植株中表達量遠遠高于野生型植株，說明超表達DWF4基因促進了轉基因植株內源BR提高，因此BES1和BZR1基因轉錄水平升高從而維持植株體內BR平衡．BR結合BRI1感受器激活BIN2，調節植株生長，BIN2對BES1和BZR1這兩個轉錄因子的磷酸化起著重要作用，是BR信號途徑中重要的調控因子[25]．BIN2基因的表達應與BES1和BZR1基因表達相一致．在本文實驗結果中，BIN2基因的表達與BZR1基因表達趨勢基本一致，在轉基因植株中表達量升高，這與理論結果相同．擬南芥質膜蛋白組學研究發現BR信號激酶BSKs，磷酸化的BSKs可以和BR受體激酶BRI1相互作用[26]．在圖8中可以得知，超表達DWF4基因促進了BSKs的表達．綜上所述，通過定量PCR[27]實驗結果顯示，超表達DWF4基因促進了植株內源BR水平的提高，因此維持體內BR平衡的BAK1，BAS1，BES1，BZR1，BIN2，BSKs基因都各有升高．