氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究

王以云 王秀艷 段春艷

摘要：目的：建立氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法的要求，采用兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)，并對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果：氟維司群用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和二甲基亞砜溶解成10mg·ml-1的溶液稀釋至80倍時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。結(jié)論：可采用此法對(duì)氟維司群的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查。

關(guān)鍵詞：氟維司群;細(xì)菌內(nèi)毒素;凝膠法;干擾試驗(yàn)

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖，極微量（1ng/kg）的內(nèi)毒素進(jìn)入人體即可引起發(fā)熱反應(yīng)。大劑量的內(nèi)毒素可引起機(jī)體發(fā)生內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭等反應(yīng)，甚至導(dǎo)致死亡。故注射劑中內(nèi)毒素內(nèi)毒素含量應(yīng)嚴(yán)格控制，生產(chǎn)注射劑所使用的原料中內(nèi)毒素的含量也應(yīng)進(jìn)行控制，以保證注射劑的安全性。

氟維司群是一種抗腫瘤藥，屬于競(jìng)爭(zhēng)性雌激素受體拮抗劑，可阻斷雌激素的作用而本身沒有激動(dòng)受體作用。主要用于絕經(jīng)后（包括自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng)）婦女在抗雌激素輔助治療后或過程中復(fù)發(fā)、或在抗刺激素治療期間疾病進(jìn)展的雌激素受體陽性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。本研究對(duì)氟維司群細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的可行性進(jìn)行方法學(xué)研究，為該原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供依據(jù)。

1、儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)材料

鱟試劑，靈敏度為0.06EU·ml-1，規(guī)格：0.1ml，批號(hào)2003252，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)19090412，福州新北生化工業(yè)有限公司;細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，效價(jià)9000EU·支-1，批號(hào)150800-201601，廠家中國(guó)食品藥品檢定研究院;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水50ml·瓶-1，批號(hào)：1910100，湛江安度斯生物有限公司;二甲基亞砜，批號(hào)200227，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2儀器

GZX-9246MBE電熱恒溫干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），XW-80A型漩渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司），HH-8型恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司），XSR204型萬分之一天平（梅特勒-托利多），移液器（賽托利斯）。

1.3樣品

氟維司群，批號(hào)：633200201、633200301、633200302，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司。

2、方法與結(jié)果

2.1菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，確定原輔料的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（總細(xì)菌內(nèi)毒素之和小于制劑限度）。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：每1mg氟維司群中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.5EU·mg-1。

2.2鱟試劑靈敏度復(fù)核

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表1。兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品檢查，λc與λ均一致，結(jié)果均復(fù)核規(guī)定。

2.3最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算

氟維司群供試品溶液的配制：稱取供試品100mg，加入1mlBET水，再加入9ml的二甲基亞砜，混勻溶解既得C=10mg·ml-1的供試品溶液。

最大有效稀釋倍數(shù)（Maximum valid dilution，MVD）MVD= CL/λ為根據(jù)，C為供試品溶液濃度10mg·ml-1，L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.5EU·mg-1，λ為鱟試劑的靈敏度0.06EU·ml-1，則MVD=83倍。

2.4干擾實(shí)驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，用兩個(gè)廠家標(biāo)示靈敏度為0.06EU·ml-1的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算MVD=83倍，方便樣品的稀釋及干擾實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的加入，選擇80倍進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

稱取供試品100mg，共稱取四份，每份分別加入1ml含100EU/ml、50EU/ml、25EU/ml、12.5EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，每份再分別加入9ml的二甲基亞砜，溶解混勻后每份溶液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成含內(nèi)毒素濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的供試品溶液。每份供試液稀釋10倍時(shí)產(chǎn)生絮狀沉淀，靜置沉淀取水相進(jìn)行下一步稀釋。

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成濃度為0.125、0.06、0.03、0.015EU·ml-1的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液;同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照。根據(jù)公式antilg（∑X/4）分別計(jì)算出內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從以上干擾結(jié)果，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，含供試品的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值均在0.5λ～2λ之間，80倍供試液對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)無干擾作用。

2.5供試品內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

將三批供試品分別稱取100mg，加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，再加入9ml的二甲基亞砜，溶解混勻后用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋10倍、20倍、40倍、80倍制成供試品溶液;供試液稀釋10倍時(shí)產(chǎn)生絮狀沉淀，靜置沉淀取水相進(jìn)行下一步稀釋。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表3。三批供試品細(xì)菌內(nèi)毒素均符合規(guī)定，即內(nèi)毒素含量小于0.5EU·mg-1。

3、討論

細(xì)菌內(nèi)毒素隨注射劑進(jìn)入人體血液所導(dǎo)致的“熱源反應(yīng)”是注射劑臨床應(yīng)用中發(fā)生率較高的不良反應(yīng)，細(xì)菌內(nèi)毒素是注射劑質(zhì)量檢查的重要項(xiàng)目。氟維司群作為注射劑原料，從生產(chǎn)源頭控制細(xì)菌內(nèi)毒素。本文按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法—凝膠法”進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究，結(jié)果表明氟維司群用溶劑溶解混勻后，稀釋80倍時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，可在大于或等于此稀釋倍數(shù)下采用凝膠法進(jìn)行氟維司群的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，從而控制供試品的內(nèi)毒素含量在限值范圍內(nèi)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，確保患者用藥安全。

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