一種透射電鏡離散細胞的樣品制備法

孫竹林 姬 曼 趙君朋

(首都醫科大學中心實驗室電鏡室，北京 100069)

透射電鏡(Transmission Electron Microscopy TEM)是生命科學領域超微形態學研究的重要手段。TEM生物樣品制備過程復雜且步驟繁多，因此樣品制備對實驗的成敗至關重要。其中離散細胞樣品(如血液，胸腹水樣本等)因其細胞數量少、且相對分散，這類樣品的收集制備一直是個難題[1-3]。以往，離散細胞樣品通常采用離心沉淀法先將細胞懸浮后離心，積聚成團塊再進行常規電鏡制備[1]。此方法一般要求有足夠的細胞數量，細胞離心后易成團且比較牢固，不然制備過程中經多次換液、離心處理后很難得到足量細胞樣品，最終導致制樣無預期結果[1-4]。有研究用明膠預包埋法處理離散細胞樣品，但該方法的明膠溫度難以控制，容易造成細胞變形等問題[2-4]。本研究采用天然蛋白膠體(蛋清)對離散細胞樣品進行預包埋處理，既易保存樣品原有數量，又不影響固定包埋效果。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：2.5%戊二醛；1%鋨酸；0.1mol/L 磷酸緩沖液；spon812樹脂；乙醇；環氧丙烷。

儀器：透射電子顯微鏡1400Plus；超薄切片機UC6；全自動組織處理機EM TP；烤片臺；烤箱。

1.2 方法

1.2.1細胞的收集

分別取大鼠骨髓全血和血管平滑肌細胞懸液各1.5mL入尖底離心管，離心15min(1500轉/min)棄上清。

1.2.2固定與漂洗

加2.5%戊二醛固定液(4℃預冷)固定1h。適量0.1mol/L 磷酸緩沖液漂洗3次，每次5min。

1.2.3預包埋

首先將已處理的細胞團吸取至濾紙上吸干水分，隨后取新鮮雞蛋開小孔，吸取適量蛋白(蛋清),滴于預熱的載玻片表面(約50μL/滴)，待蛋白微凝時(呈灰白色)，將細胞轉移至蛋白凝塊，使其包埋于其中，再次將載玻片置烤片臺上加熱至蛋白完全凝固狀態(呈白色)。

1.2.4后固定

將預包埋后的細胞白色混凝團轉入1%鋨酸固定液中固定1h(4℃)。隨后再次漂洗，條件同上。

1.2.5脫水滲透

經梯度乙醇50%、70%、90%、100%和環氧丙烷逐級脫水處理后(5min/次，各級2次)，再經spon812環氧樹脂:環氧丙烷1∶1、3∶1，各40min，最后純樹脂浸透2h。

1.2.6包埋聚合

將樣品轉移至包埋模具中，置恒溫干燥箱中升溫聚合。聚合溫度與時間分別為37 ℃，12h；45℃，12h；60℃，48h。

1.2.7切片染色

聚合后的包埋塊經超薄切片機制備100nm超薄切片，置銅網上。先后用醋酸雙氧鈾15min、檸檬酸鉛3min雙染色。

1.2.8電鏡觀察

采用透射電鏡1400Plus于100kV觀察，分析軟件收集圖像。

2 結果

2.1 未預包埋組

兩組細胞經過逐級脫水、滲透等步驟后，大部分已丟失，經包埋聚合，因殘留樣品太少，不能滿足修塊、切片的要求，無法進行超薄切片觀察。

2.2 預包埋組

2.2.1骨髓細胞組樣品

透射電鏡下可見細胞呈集中分布，細胞間干凈，種類豐富，形態多樣，紅細胞呈扁平狀、淋巴細胞可見明顯偽足樣突起；樣品圖像反差明顯，分辨率清晰，細胞間蛋白組織未見電子反差的異常現象(圖1A)。超微結構觀察可見各類細胞超微結構保存良好，細胞及細胞器的膜性結構完整，核膜及染色質清晰可見(圖1B)。

2.2.2血管平滑肌細胞組樣品

電鏡下可見樣本背景清晰整潔，細胞亦呈集中分布，細胞間距合理，無擠壓、破損等形變，細胞間可見蛋白纖維，反差正常，對結構觀察無干擾(圖2A)；超微結構觀察細胞膜清晰可見，表面的微絨毛突起，線粒體、內質網等細胞器結構完整；細胞核、核膜及染色質均完整清晰(圖2B)。

圖1 預包埋組骨髓細胞透射電鏡圖

由圖1可知，預包埋組骨髓細胞(圖1 A )細胞結構反差明顯，分辨率清晰，細胞間未見電子反差的異常現象(bar=2μm)；超微結構觀察細胞膜清晰可見(圖1B)，表面的突起，線粒體、內質網等細胞器結構完整(bar=0.5μm)。

圖2 預包埋組血管平滑肌細胞透射電鏡圖

圖2表明，預包埋組血管平滑肌細胞 (圖2A)細胞集中分布，細胞間距合理，無擠壓、破損等形變，細胞間可見蛋白纖維，反差正常(bar=2μm)；超微結構觀察細胞膜清晰可見(圖2B)，表面的微絨毛突起，細胞器結構完整；核膜及染色質對比清晰(bar=0.5μm)；

3 討論

蛋清是由蛋白質組成的透明的膠狀物質，遇熱后會凝固成白色固體故又稱為蛋白。其主要成份為卵白蛋白，卵粘蛋白等。天然卵白蛋白加熱時膠體變性凝固，卵粘蛋白熱穩定性較強且具有較高的溶解度。因此，蛋清膠體熱變性微凝時，形成海綿狀凝膠，具有通透、保濕及防震保護的作用[5]。

本實驗結果顯示，蛋清包埋離散細胞樣品中細胞呈集中分布，說明蛋白膠體易于細胞粘附，起到良好的聚集作用。包埋樣品處理過程中脫水完全、滲透充分，電鏡下觀察細胞膜完整，細胞偽足或突起無損傷形變，超微結構保存效果良好，說明蛋白膠體通透性良好，且具有保護細胞表面的功能[5]。同時，實驗結果也顯示：包埋膠體蛋白未與樹脂及染色顆粒發生化學變化，超薄切片厚度均勻穩定，質量滿意。經醋酸鈾及檸檬酸鉛染色后，蛋白無異常，細胞分辨率和反差效果均良好。為了獲得良好的實驗結果，實驗中需注意的以下事項：首先要使用新鮮蛋白，4℃儲存蛋清不易凝固，影響包埋效果；其次，預包埋過程中，注意掌握凝固顏色和狀態，蛋清由微黃色變成灰白色時，為膠體微凝狀態，黏度適中有利于離散細胞的粘附與包裹；再者，制備過程中要避免牽拉、擠壓或沖擊等外力直接作用于包埋膠體，造成蛋白包埋體開裂分散。如可用木簽或細針頭輔助完成膠體包埋和轉移，脫水、滲透等環節可使用樣品處理儀替代人工換液。

該方法無需設備和試劑投入，具有簡便快捷、易于操作、適用于多種細胞且效果顯著等優點，為離散細胞超微結構的研究提供了一個實用、廉價的樣品制備方法。