液相聯用原子熒光形態價態儀測定安宮牛黃丸中可溶性形態價態砷的方法研究

(上海市崇明食品藥品檢驗所，上海 202150)

1 引言

安宮牛黃丸被譽為“中醫溫病三寶”之首，是《中國藥典》2015年版一部收載品種[1]，自《中國藥典》1977年版一部收載后，歷版藥典均有收載。

按照中醫理論分析：處方中牛黃苦涼，清心解毒，辟穢開竅[2],在此方中具有重要意義。歷年來廣大醫藥工作者對于安宮牛黃丸的基礎研究、臨床應用和藥理藥效等方面做了非常大量的研究工作，作為中醫治療高熱癥最為有效的要方，其機理已由藥理實驗和臨床療效初步進行了科學的闡明[3]。但是作為中醫藥獨有的礦物藥，雄黃(二硫化二砷As2S2)中含大量砷(70%)，故而被列入國家醫用藥品毒性藥品目錄。在臨床實踐和日常生活中，有關這類中藥的毒性也經常見諸報端：端午節飲用“雄黃酒”致命、長期服用“牛黃解毒片”產生中毒癥狀，或是民間豬心加朱砂熬湯后急性中毒等，其原因主要是由于對于該類藥物的普遍認知不足[4]和藥物的不合理運用。

安宮牛黃丸中的雄黃的安全性和有效性根據文獻報道,可對其價態砷的定量來衡量評價[4]，在了解雄黃的作用機制的基礎上，解決安宮牛黃丸中可溶性砷的價態檢驗項目設置、方法學摸索和限度標準設定，進行深入研究和確定合理的質量分析方法，保障人民用藥安全。目前國內及國際通用測定砷形態價態的主流方法為HPLC-ICPMS,該儀器在藥品檢測領域主要依賴進口，購買成本及后期使用成本較高，而原子熒光形態分析儀是我國具有完全自主知識產權和生產能力的儀器，而且購買和后期使用成本相對較低，所以開發原子熒光形態分析儀的檢驗檢測方法即有利于降低藥企質控成本，又能推動我國自主儀器研發的能力和動力。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與材料

液相聯用形態價態儀(液相泵：LUMTECH Clamflowplus；進樣器：LUMTECH Autosampler；形態：儀器形態預處理裝置 SAP-20；原子熒光：AFS-9320)；QUINTIX224-1CN萬分之一電子天平；BRANSON 8510超聲清洗儀；VORTEX GENIE 2渦旋振蕩儀；SIGMA 3-18K高速離心機；HPLC-ICPMS(U3000-ICAPQ)；Milli-Q A10純水機。

硝酸(色譜純)；氫氧化鉀(分析純)；硼氫化鉀(分析純)；乙二胺四乙酸二鈉(分析純)；磷酸二氫銨(分析純)；胰酶(分析純)；純水(電阻率≥18MΩ)。

砷酸根標液(GBW08667，批次1804，純度以As計：17.5±0.4μg/g)；亞砷酸根標液(GBW08666，批次1804，純度以As計：75.7±1.2μg/g)。

安宮牛黃丸3批：廣州某藥業有限公司(批號：X03003M，規格：每丸重3g)；杭州某藥業有限公司(批號：180407，規格每丸重3g)；北京某制藥廠(批號：17013721，規格每丸重3g)。

2.2 實驗方法

2.2.1標準溶液的制備

精密稱取砷酸根標液0.5715g，亞砷酸根標液0.1322g，置于同一個20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成砷酸根(As5+)濃度為500ng/mL、亞砷酸根(As3+)500ng/mL(均以砷計)的標準儲備液。精密量取5mL置10mL量瓶中，加0.02mol/L的乙二胺四乙酸二鈉溶液至刻度制成250ng/mL(以砷計)的標準儲備液。

2.2.2標準曲線制備

取250ng/mL的混合標準儲備液，通過儀器自動調整進樣量，稀釋制成含As5+12.5、25、50、75、125、250ng/mL，含As3+12.5、25、50、75、125、250ng/mL的系列混合標準溶液，分別測定峰面積，以砷酸根、亞砷酸根系列標準濃度為橫坐標，以測定的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線方程和相關系數。

2.2.3樣品處理

取廣州某藥業公司的安宮牛黃丸作為測試樣品，剪碎并混勻，取約0.15g，精密稱定，置250mL量瓶中，加人工腸液5mL靜置1小時使充分膨脹后，加人工腸液適量渦旋2分鐘，再靜置半小時，再渦旋2分鐘后超聲半小時，取出渦旋2分鐘后靜置1小時，再渦旋2分鐘，靜置超聲均在37℃條件下進行，用人工腸液定容至刻度，搖勻，取適量至50mL離心管中，靜置16小時，取中間液10mL，用10μm微孔濾膜過濾，精密量取濾液2.5mL至10mL量瓶中，加0.02mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4儀器條件

(1)液相條件：流動相：0.025mol/L磷酸二氫銨溶液(調節pH至6.0)；流動相流速：1.5mL/min；色譜柱：CNWSEP AX HPLC Colum 250×4.0mm 10μm；進樣量：滿環100μL，自動稀釋最小進樣量5μL。

(2)原子熒光條件：負高壓320V，總電流80mA，輔電流40mA，載氣300mL/min，屏蔽氣500mL/min。(3)形態分析儀條件：載液：5%硝酸；還原劑0.35%氫氧化鉀及2%硼氫化鉀混合溶液。

3 結果

3.1 標準曲線

As3+在12.5～250ng/mL，As5+在12.5～250ng/mL的范圍內均呈現良好的線性關系，結果見表1，色譜圖見圖1。

表1 標準曲線和相關系數

圖和標準曲線峰面積疊加譜圖

3.2 重復性和中間精密度結果

取廣州某藥業公司樣品，精密稱取0.15g，0.3g，0.45g 3個重量梯度并每個重量梯度稱取3份，照2.2.3進行樣品處理，并將處理后樣品分別通過液相聯用原子熒光形態價態儀和HPLC-ICPMS測定。

表2 液相聯用原子熒光測定結果

續表2

表3 電感耦合等離子質譜儀測定結果

續表3

3.3 穩定性試驗結果

3.3 回收率試驗結果

取廣州某藥業公司樣品，精密稱取9份，每份約0.15g，平均分成3組，分別加入3個濃度梯度砷酸根與亞砷酸根標液，照2.2.3進行樣品處理，并將處理后樣品通過液相聯用原子熒光形態價態儀測定。

圖2 液相聯用原子熒光形態價態儀測定樣品譜圖

試驗結果表明,液相聯用原子熒光分離安宮牛黃中的價態砷的三水平加標As3+的回收率分別為118.4%、103.3%、101.6%，As5+回收率分別為112.6%、108.5 %、102.0 %，回收率在該條件下的結果均在85%～120%之間，基本滿足藥品質量標準分析方法指導原則項下的準確度要求[5]，具體結果見表4。

表4 As3+與As5+加標回收率

3.5 實驗結果

通過同法試驗測定，杭州某藥業公司的安宮牛黃丸As3+結果為140.3mg/kg，As5+測定結果為26.43mg/kg；北京某藥廠的安宮牛黃丸As3+結果為134.4mg/kg，As5+測定結果為24.90mg/kg。測定結果表明，這3個廠家的3批安宮牛黃價態砷的含量都處于比較安全的范圍。

4 小結與討論

本次試驗在初期探索儀器條件時期發現，使用梯度洗脫時，可對4種砷的價態(砷酸根，亞砷酸根，一甲基砷、二甲基砷)進行很好的分離，但由于安宮牛黃丸中3個批次都沒有檢出一甲基砷和二甲基砷，故最后采用了檢出能力更高的等度洗脫，穩定性也更好。在樣品前處理方法探索時，發現提取液中價態砷的含量呈現隨時間推移從低到高再到基本穩定的狀態，故最后確定本試驗最終的一個樣品前處理方法。通過本次試驗，基本建立一套完整的液相聯用原子熒光形態價態儀測定安宮牛黃丸中的模擬人體環境的可溶性形態砷的定量測定方法，即完成了對安宮牛黃丸該品種的質量控制的完善，也為國內儀器廠商提供了新的道路。