LC-MS/MS法測定人體血清中脂溶性維生素濃度

陳敏純 張婧一 鄭 潔 王 新 劉生元 曹 青 閆抗抗

(西北大學附屬醫院/西安市第三醫院藥劑科，西安 710018)

維生素(Vitamin)是維持人體健康的必需微量元素，其以酶或輔酶的形式參與人體新陳代謝過程，調節人體的生長、發育[1]。維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、維生素E是脂溶性維生素，因人體不能合成或合成的維生素極其微量，只能從食物中攝取。脂溶性維生素攝取不足或缺乏，易導致人體生理機能、新陳代謝、細胞調節等障礙，誘發多種疾病[2-4]。一般而言，成人均衡膳食無需額外補充脂溶性維生素，但特殊人群如孕婦，老年人，骨質疏松患者以及兒童普遍缺乏維生素，若盲目補充大量，易蓄積致中毒。如早期妊娠婦女攝取大量維生素A(攝入量≥10000IU)增加嬰兒出生缺陷風險[5]。對于存在營養吸收障礙者、有肝臟疾病者以及炎癥性腸病者或生長遲緩兒童，應常規監測脂溶性維生素的濃度。對于這些特殊人群者，通常每6個月監測1次，具體監測頻率取決于疾病的嚴重程度[6]。故科學、精準的檢測人體脂溶性維生素含量，可準確評估、篩查脂溶性維生素維生素異常狀態，針對性進行個體化調整補充，提高維生素治療的安全性有效性。本實驗研究建立LC-MS/MS法同時測定人體血清中脂溶性維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E的質量濃度，所需樣本量少(200μL血清)，樣品前處理簡單(正己烷萃取法)，采用同位素內標，消除人體血清中的不同內源性物質對維生素檢測的基質效應，準確度高且一次性檢測4項脂溶性維生素，為臨床評估脂溶性維生素含量提供可靠的檢測方法。

1 儀器與試劑

液質聯用儀(液相色譜儀LC-30A，質譜儀LC-MS 8040三重四級桿，LC-30AD×2 輸液泵，SIL-30AC 自動進樣器，CTO-20AC 柱溫箱)；色譜工作站：LabSolution；高速冷凍離心機(H2050R)；渦旋儀(MTV-100)；氮吹儀(MTN-2800D )。

甲醇為色譜級試劑；正己烷為色譜級；甲酸為色譜級純試劑；標準品維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E和穩定同位素內標A-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6購自于生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，9048-46-8)。

2 方法與結果

2.1 LC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：Zorbax Extend-C18 柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm，)；流動相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸甲醇；梯度洗脫，0～2min，85% B相-100% B相，2～6min，100% B相；柱溫：45 ℃；流速：0.6 mL/min；進樣量：50 μL。質譜條件：采用ESI源正離子模式；霧化氣流量：2.5 L/min；干燥氣流量：15 L/min；DL 溫度：200 ℃；加熱塊溫度：300 ℃；用于定量分析的4種維生素和內標最優的MRM參數見表1。

表1 4種維生素及其內標最優的MRM參數

2.2 溶液配制

用甲醇配制2.536 mg/mL、0.200 mg/mL、0.200 mg/mL、20.480 mg/mL的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE混合標準儲備液，將儲備液逐級稀釋，VA的標準工作液為0.5072、1.268、2.536、6.340、12.680、25.360 μg/mL；25-OH-D2和25-OH-D3的標準工作液為0.040、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000 μg/mL；VE的標準工作液為4.096、10.240、20.480、51.200、102.400、204.800 μg/mL。內標工作液濃度為20 ng/mL。

2.3 樣品前處理

用移液器精密吸取200 μL內標工作液加入200 μL血清樣品，渦旋震蕩1 min，吸取900 μL 正己烷，渦旋震蕩5 min，置于4℃、12000 rpm超高速離心機中離心10 min，吸取600 μL 上清液，于氮吹儀中吹干，用100 μL的 70%甲醇水復溶，渦旋震蕩2 min，置于4℃、12000 rpm超高速離心機中離心3 min，取上清液 90 μL進樣分析檢測。

2.4 標準曲線配制與檢測限

稱取0.4 g BSA溶于10 mL水中，配制成4% BSA溶液作為代替血清的基質溶液，用于配制標準曲線。用移液器吸取180 μL基質溶液，精密吸取20 μL不同濃度的標準工作液和200 μL內標工作液，依次配制成標準曲線。按“2.3”項下處理，分析檢測記錄VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE面積與內標色譜峰面積。峰面積比Y對濃度(X，μg/mL)進行線性回歸(權重為1/C)，回歸方程Y=bX+a。結果表明各維生素色譜響應的相關線性關系良好。配制20份樣品濃度VA為0.057 μg/mL、25-OH-D2為0.004 μg/mL、25-OH-D3為0.004 μg/mL、VE為0.409 μg/mL進行分析，統計峰面積比，計算精密度值<20%，表明VA為0.057 μg/mL，25-OH-D2為0.004 μg/mL，25-OH-D3為0.004 μg/mL，VE為0.409 μg/mL可作為方法檢出限。各個維生素的線性范圍、直線回歸方程、線性相關系數、檢測限如表2所示。

表2 脂溶性維生素線性范圍、回歸方程、相關系數及檢測限

2.5 方法專屬性

在本試驗條件下，檢測空白基質溶液、空白基質溶液加入脂溶性維生素標準品和內標及患者血清中脂溶性維生素和內標。結果表明，血清中內源性物質對脂溶性維生素樣品峰的測定無干擾。本方法具有較高的特異性，色譜圖見圖1。

圖1 脂溶性維生素色譜圖A.4% BSA加入高質控樣品及內標；B.患者脂溶性維生素色譜圖

2.6 精密度和準確度

平行制備低、中、高質控樣品各8份，連續3d進樣分析，計算日內、日間精密度和準確度，結果見表3。

表3 方法精密度準確度及提取回收率(n=8)

續表3

2.7 回收率與基質效應

取180μL基質溶液，分別吸取20 μL低、中、高質控濃度的標準工作液和200 μL內標工作液，每個濃度分析8份樣品，按“2.3”項下處理，進行分析記錄峰面積A。取180 μL水，分別吸取20 μL低、中、高質控濃度的標準工作液和200 μL內標工作液，按“2.3”項下處理，進行分析記錄峰面積B。取180 μL空白血清分別吸取20 μL低、中、高質控濃度的標準工作液和200 μL內標工作液，按“2.3”項下處理，進行分析記錄峰面積C。取180 μL空白血清，按“2.3”項下處理，進行分析記錄峰面積D。A/B為本方法的基質效應，(C-D)/A為本方法的加標回收率。結果見表3。

2.8 基質溶液與空白血清的基質一致性驗證

分別用4% BSA 基質溶液和空白血清依照“標準曲線配制”中的方法，配制標準曲線溶液，進樣分析，繪制出BSA基質標曲Y=bX+a和血清基質標曲Y=b'X+a'，依據標準加入法外推X 軸負截距，計算空白血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE的含量分別為0.4036、0.0031、0.0603、7.3964 μg/mL。分別制備空白血清及血清加入低、中、高質控濃度的標準工作液和200 μL內標工作液，每個濃度分析8份樣品，按“2.3”項下處理，進樣分析后根據4% BSA基質溶液標準曲線計算目標物質濃度。結果顯示，使用4% BSA 基質溶液標準曲線測定各組樣品，其檢測均值和理論值相對誤差均<15%，變異系數<15%，均在可接受范圍之內。

2.9 臨床樣本檢測結果

應用所建立LC-MS/MS法測定20名健康者血清中脂溶性維生素，結果范圍如表4所示。各臨床樣品測定數值均在正常范圍內，因此該方法適用于臨床血清樣品的檢測。

表4 健康者血清脂溶性維生素檢測結果

3 討論

維生素A有多種生物學調節作用，預防干眼癥、角膜和結膜發育異常，同時對眼部的細胞分化有重要作用。根據世界衛生組織2018年數據顯示，全球5歲以下兒童的VA缺乏癥患病率約為30%，許多營養不良的兒童和成人出現夜盲癥、失明和干眼癥。VA缺乏癥的診斷是通過其臨床表現，若測量血清VA濃度低于0.2 μg/mL也可支持診斷[7]。維生素E是保護細胞膜免受氧化和破壞。VE缺乏可導致溶血、神經肌肉疾病、共濟失調和周圍神經病變。由于人類飲食中含有豐富的VE，VE缺乏癥很少見，除非患有膽汁淤積性肝病、胰腺功能不全或其他導致脂肪吸收障礙或蛋白質吸收不良的人，對于有維生素E缺乏風險因素的患者需常規監測VE含量。維生素D除了在鈣和骨穩態中發揮作用以外，其還調節細胞增殖、免疫和肌肉功能、皮膚分化和生殖以及血管和代謝特性[8]。維生素D缺乏(血清25-OH-D濃度 <20 ng/mL)會加速骨轉換、骨丟失和骨質疏松性骨折。若大劑量補充維生素D使血清25-OH-D濃度超過50 ng/mL，則會增加跌倒風險[9]。25-OH-D2和25-OH-D3是25-OH-D的兩種形式，他們具有不同強度的生物學調節作用，研究認為應對這兩種形式進行分別檢測，在美國國家標準和技術研究院(National Institute for Standards and Technology,NIST)標準下，LC-MS/MS技術是測定維生素D為最準確的技術[10]，而應用免疫法則無法區分25-OH-D2和25-OH-D3。因此，應用LC-MS/MS技術不僅可區分和定量25-OH-D不同亞型，也可同時檢測多種脂溶性維生素，為臨床醫生對維生素異常者進行醫學干預提供重要的參考意義。

脂溶性維生素在人體中含量差異大，如VA和VE在正常人中含量高達μg/mL級別，而25-OH-D2和25-OH-D3則為ng/mL級別，LC-MS/MS技術同時檢測這幾種化合物不僅可滿足其高靈敏度需求，也同時滿足線性相關性。因脂溶性維生素的官能團和分子結構不同，導致其極性差異大，VA、25-OH-D2和25-OH-D3的極性相對較強，在色譜柱上易被洗脫，而VE則極性較弱，難以被洗脫，故本研究流動相采用梯度洗脫，0.1%甲酸甲醇溶液由85%逐步上升到100%進行洗脫。此外，本研究采用同位素內標，以消除人體血清中的不同內源性物質對維生素檢測的基質效應，大大提高檢測結果的準確性。

維生素是人體內源性物質，正常人血清中含有一定量的脂溶性維生素，不宜使用空白血清建立標準曲線進行定量，故本研究采用4% BSA溶液作為血清的替代基質溶液，同時對4% BSA替代基質溶液與血清基質溶液進行一致性驗證，檢測均值和理論值相對誤差<15%，變異系數<15%，均在可接受范圍之內。LC-MS/MS法對化合物進行定量檢測時，在不同基質溶液中該化合物的溶解度及離子響應度則不同，為減小差異及影響，本研究在質量控制技術上采用的是加標回收率，確保試驗技術的可靠性。

本研究通過4% BSA基質溶液替代空白血清配制標曲，正己烷萃取法及內標定量法，建立了在6 min內測定血清中脂溶性維生素的分析方法，并按照臨床檢驗相關指導原則進行方法學驗證。實驗結果表明，該方法分析速度快、準確度和精密度好，適用于臨床實驗中測定人血清中脂溶性維生素的含量，指導相關疾病治療及臨床合理用藥。