經支氣管鏡針吸活檢術在肺癌術前病理分型中的應用價值研究

王妍，石芳，劉俊霞，顏晶晶

肺癌作為世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國有著較高的發病率和死亡率，因為多發生于支氣管黏膜上皮，所以也被稱為支氣管肺癌，其主要因為肺組織細胞產生不受機體控制的分裂，然后增殖而導致惡性病變［1-2］。臨床常見的肺癌包括非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）及小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC又包括腺癌（glandular cancer，AC）、鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）等，不同類型肺癌治療手段有明顯差別，如果在術前不能對肺癌分型進行準確評估，那么可能因為選擇不適當的手術方式而影響手術效果，最終難以改善患者預后，而術前正確進行組織學分型和分子病理學分型成為幫助患者獲得有效治療的重要保障［3］。由于肺癌患者肺內病灶在影像學上的表現通常不典型，臨床常通過支氣管鏡獲取活檢組織進行分子標志物檢測［4］。但普通支氣管鏡活檢僅適用于肺內病變即中央型肺癌及部分周圍型肺癌，不能對管腔黏膜內明顯腫瘤侵犯的占位性病變及縱隔或淋巴結腫大患者進行完全探查，而經支氣管鏡針吸活檢術具有獨特優勢，其探查范圍相對更廣，能對管腔黏膜內明顯腫瘤侵犯的占位性病變及縱隔和淋巴結腫大患者進行完全探查［5］，但由于其抽取的標本量較少，其病理分型的準確性還有待進一步研究證實［6-7］。本研究通過回顧性分析2017年10月至2020年10月在河北醫科大學附屬燕達醫院、河北中石油中心醫院接受手術治療的180例肺癌患者的臨床資料，探討經支氣管鏡針吸活檢術在肺癌術前病理分型中的應用價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性選取2017年10月至2020年10月在河北醫科大學附屬燕達醫院、河北中石油中心醫院進行手術治療的肺癌患者180例為研究對象，按照術后病理組織活檢結果將其分為AC組（n=82）、SCC組（n=58）及SCLC組（n=40）。三組患者性別、年齡、吸煙率（過去1年內吸煙或每天吸煙1支及以上判定為吸煙）、TNM分期、淋巴結轉移發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。所有患者術前行經支氣管鏡針吸活檢術，為確保患者隱私，本研究所有數據未泄露給研究以外人員。本研究經河北醫科大學附屬燕達醫院倫理委員會審核批準。

表1 三組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data in the three groups

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）參照《肺癌影像診斷與臨床新進展》［8］相關標準，經術前影像學檢查及術后病理組織活檢診斷為AC、SCC或SCLC的患者；（2）年齡45～75歲；（3）TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期，且可行全肺切除術或肺葉切除術；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）非原發性肺癌者；（2）合并其他部位腫瘤或呼吸系統相關疾病者；（3）不可手術治療者；（4）無法耐受支氣管鏡檢查者；（5）伴有上腔靜脈綜合征或存在出血傾向者。

1.3 經支氣管鏡針吸活檢術 術前詢問患者病史，并完善心電圖、胸部影像學等檢查，入手術室后行常規生命體征監測，建立靜脈通道后給予靜脈全身麻醉，根據術前影像學檢查顯示的腫大淋巴結或縱隔腫物進行穿刺；在超聲引導下選擇合適路徑對病灶進行穿刺，采用22 G穿刺針連同針芯插入內徑管道，固定好穿刺針后根據病灶大小對進針長度進行調整，插入后連接負壓注射器，維持5～15 ml負壓后反復抽取細胞及組織樣本；送檢病理科后將其置于細胞凍存管中，于液氮中保存待用。ENDOECHO EU-MEI型超聲主機為Olympus公司生產，BF-UC-260FW型超聲光纖電子支氣管鏡為Olympus公司生產，NA201SX-4022型穿刺吸引活檢針為Olympus公司生產。

1.4 實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測分子標志物表達水平先對凍存的病理組織樣本進行提取，使其在室溫下放置5 min至完全溶解，在裂解樣品中加入0.2 ml三氯甲烷，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，將配制好的PCR反應溶液置于PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93 ℃預變性2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸7 min。檢測的分子標志物分別為甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF-1）、Napsin A、細胞角蛋白5（cytokeratin 5，CK5）、細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、P40、P63、Ki67，采用配套試劑盒，儀器為BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。使用引物列表對其進行DNA聚合反應，TTF-1上游引物為5'-CGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGA-3'、下游引物為5'-CCTCCATGCCCACTTTCTTG-3'，Napsin A上游引物為5'-GACAAGCCCATCTTCGTACCTCT-3'、下游引物為5'-TCCACAGACAGAATGGGAAAACC-3'，CK5上游引物為5'-ATCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3'、下游引物為5'-AAACACTGCTTGTGACAAGAGAG-3'，CK7上游引物為5'-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3'、下游引物為5'-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3'，P40上游引物為5'-GAACGCATTGCCACATAC-3'、下游引物為5'-AGGCACCTGACCCTTGTA-3'，P63上游引物為5'-GGAAAACAATGCCCAGACTC-3'、下游引物為 5'-GCGCGTGGGTCTGTGTTAAG-3'，Ki67上游引物為5'-GCAGGACTTCACTTGCTTCC-3'、下游引物為5'-TCATTTGCGTTTGTTTCACG-3'，內參GAPDH上游引物為5'-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'、下游引物為5'-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGA-3'。

1.5 觀察指標 （1）比較三組患者分子標志物（TTF-1、Napsin A、CK5、CK7、P40、P63、Ki67）表達水平。（2）以術后病理組織活檢結果為“金標準”，分析分子標志物對AC、SCC及SCLC的診斷價值；術后病理組織切片經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后采用免疫組化法進行染色，染色結果由染色深度及陽性細胞百分比進行綜合判斷。其中染色深度評分方法為：無著色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分；陽性細胞百分比評分方法為：陽性細胞百分比≤10%記為1分，10%＜陽性細胞百分比≤25%記為2分，25%＜陽性細胞百分比≤75%記為3分，75%＜陽性細胞百分比≤100%記為4分。綜合評分=染色深度評分×陽性細胞百分比評分，最終根據綜合評分分別劃定為陰性（-）（0分）、陽性（+～+++）（1～12分），采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照［9］。TTF-1、Napsin A及CK7均為陽性則診斷為AC，CK5、P40及P63均為陽性則診斷為SCC，TTF-1、P40及Ki67均為陽性則診斷為SCLC。所有切片由2位經驗豐富的病理醫師單獨鑒定，儀器為美國貝克曼公司生產的BENCHMARK XT全自動免疫組化機，單克隆抗體均為配套。（3）記錄患者經支氣管鏡針吸活檢術后并發癥發生情況。

1.6 統計學方法 采用EpiData 3.1建立數據庫，運用SPSS 17.0對數據進行統計分析。計量資料均符合正態分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用四格表計算分子標志物診斷AC、SCC及SCLC的正確率、靈敏度、特異度；一致性檢驗采用Kappa檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者分子標志物表達水平比較 三組患者TTF-1、Napsin A、CK5、CK7、P40、P63、Ki67表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。SCC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達水平低于AC組，CK5、P40、P63表達水平高于AC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；SCLC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達水平低于AC組，P40、Ki67表達水平高于AC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；SCLC組患者TTF-1、Ki67表達水平高于SCC組，CK5、P40、P63表達水平低于SCC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組患者分子標志物表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of molecular marker expression levels in the three groups

表2 三組患者分子標志物表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of molecular marker expression levels in the three groups

注：TTF-1=甲狀腺轉錄因子1，CK5=細胞角蛋白5，CK7=細胞角蛋白7；a表示與AC組比較，P＜0.05；b表示與SCC組比較，P＜0.05

組別 例數 TTF-1 Napsin A CK5 CK7 P40 P63 Ki67 AC 組 82 1.34±0.37 1.38±0.36 0.74±0.21 1.20±0.21 0.75±0.24 0.87±0.24 0.68±0.24 SCC 組 58 0.58±0.27a 0.74±0.26a 1.41±0.52a 0.74±0.35a 1.38±0.33a 1.39±0.33a 0.79±0.31 SCLC 組 40 1.15±0.37ab 0.81±0.18a 0.69±0.24b 0.81±0.24a 1.24±0.28ab 0.69±0.28b 1.41±0.34ab F值 90.087 95.254 77.482 58.251 96.024 89.263 90.512 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 分子標志物對AC的診斷價值 TTF-1、Napsin A及CK7聯合檢測診斷AC的正確率為0.872，靈敏度為0.866，特異度為0.878，Kappa值為0.743，見表3。

表3 分子標志物診斷AC的四格表（例）Table 3 Four-grid table for diagnosing AC by molecular markers

2.3 分子標志物對SCC的診斷價值 CK5、P40及P63聯合檢測診斷SCC的正確率為0.878，靈敏度為0.879，特異度為0.877，Kappa值為0.730，見表4。

表4 分子標志物診斷SCC的四格表（例）Table 4 Four-grid table for diagnosing SCC by molecular markers

2.4 分子標志物對SCLC的診斷價值 TTF-1、P40及Ki67聯合檢測診斷SCLC的正確率為0.889，特異度為0.914，靈敏度為0.800，Kappa值為0.859，見表5。

表5 分子標志物診斷SCLC的四格表（例）Table 5 Four-grid table for diagnosing SCLC by molecular markers

2.5 并發癥發生情況 患者經支氣管鏡針吸活檢術后發生的并發癥主要包括氣胸、出血和感染，其發生率分別為2.2%（4/180）、2.8%（5/180）、8.3%（15/180），總并發癥發生率為13.3%（24/180）。氣胸患者給予臥床休息、充分吸氧，肺壓縮程度嚴重者給予胸腔閉式引流；出血及感染患者給予止血、抗生素治療；經治療后患者均恢復良好。

3 討論

研究表明，合并肺門淋巴結或縱隔腫大的肺癌患者通常不適合手術治療，放化療及靶向治療為其主要治療方式，但具體治療方案應根據肺癌組織病理學類型來選擇，因此術前選擇合適的標本獲取方法進行病理分型尤為重要［10-11］。本研究旨在探討經支氣管鏡針吸活檢術在肺癌術前病理分型中的應用價值，以期為臨床提供參考。

本研究結果顯示，SCC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達水平低于AC組，CK5、P40、P63表達水平高于AC組；SCLC組患者TTF-1、Napsin A、CK7表達水平低于AC組，P40、Ki67表達水平高于AC組；SCLC組患者TTF-1、Ki67表達水平高于SCC組，CK5、P40、P63表達水平低于SCC組；提示經支氣管鏡針吸活檢術取病理組織檢測上述分子標志物可能對肺癌病理類型的鑒別有一定價值。TTF-1作為一種調節甲狀腺的蛋白，是轉錄蛋白NKx2基因家族成員之一，主要分布于人體內胚層分化的甲狀腺濾泡上皮和肺泡上皮，其在肺泡上皮來源的細胞中有較高表達水平，通常用于鑒別SCC和AC。楊光等［12］研究發現，P63、TTF-1有助于診斷SCLC，然而其并未采用經支氣管鏡針吸活檢術獲取病理標本，因而其獲得的病理指標可能存在一定誤差。Napsin A是天冬氨酸的一種蛋白酶，具備蛋白水解酶活性，在Ⅱ型肺上皮細胞中廣泛分布，可誘導蛋白前體成熟、維持肺的形態及正常功能，在AC患者中呈陽性表達。CK7、CK5是一類堿性細胞角蛋白，作為中間絲蛋白，陽性顆粒主要位于細胞質，其中CK7主要表達于大部分正常組織的腺上皮和移行上皮中，因而可作為AC分化的標志性指標，且不會在鱗狀上皮上表達；CK5為高相對分子質量的角蛋白，主要表達于鱗狀上皮和導管上皮的基底細胞，臨床多作為SCC的標志物［13］。P40、P63在表皮、泌尿道、前列腺等具有鱗狀上皮分化潛在能力的基底細胞和旁基細胞中廣泛分布，因而可用于SCC的診斷。既往研究已證實，Ki67抗原表達水平越高，腫瘤細胞增殖活性越高，G1期時Ki67可呈低表達，G2、M期時其表達水平達到峰值，因此能特異性地展示細胞增殖活性［14］。SCLC的癌細胞呈淋巴細胞樣或燕麥細胞型，人為擠壓癌組織以致細胞核拉長變形在臨床極為常見，但Ki67卻在擠壓嚴重的癌組織中仍呈陽性表達，因而可用于鑒別診斷SCLC。

本研究結果顯示，TTF-1、Napsin A及CK7聯合檢測診斷AC的正確率為0.872，靈敏度為0.866，特異度為0.878，Kappa值為0.743；CK5、P40及P63聯合檢測診斷SCC的正確率為0.878，靈敏度為0.879，特異度為0.877，Kappa值為0.730；TTF-1、P40及Ki67聯合檢測診斷SCLC的正確率為0.889，特異度為0.914，靈敏度為0.800，Kappa值為0.859；提示經支氣管鏡針吸活檢術對肺癌術前病理分型具有較高的鑒別診斷價值。同時趙子龍等［15］也在肺癌病理分型的鑒別診斷中證實p63、CK5、CK6、Napsin A及TTF-1抗體可用于AC及SCC的鑒別診斷，本研究結果與之相似。同時本研究還在p63、CK5、Napsin A、TTF-1的基礎上觀察P40、Ki67鑒別診斷AC、SCC、SCLC的價值，這也是本研究的創新之處。

本研究結果顯示，患者經支氣管鏡針吸活檢術后發生的并發癥主要包括氣胸、出血和感染，總并發癥發生率為13.3%（24/180）；經治療后患者均恢復良好；提示經支氣管鏡針吸活檢術有良好的安全性。經支氣管鏡針吸活檢術作為一種安全、簡便、先進的支氣管鏡技術，只需中等程度鎮靜，準確率較高，其雖然為微創操作，但難免引起出血、氣胸風險，因而對術者操作有較高的要求［16-17］。而且操作過程中也存在因獲取組織量不足而出現漏診的情況，同時本研究并未分析淋巴結位置、穿刺淋巴結個數、組織處理等因素對結果的影響。另外，本研究由于樣本量較小，所檢測的指標可能不具有明顯的代表性，因此還需在后續研究中進一步擴大樣本量來驗證本研究結論。

綜上所述，經支氣管鏡針吸活檢術在肺癌術前病理分型中有較好的應用價值，且安全性良好，值得臨床推廣。其中TTF-1、Napsin A及CK7聯合檢測可有效診斷AC，CK5、P40及P63聯合檢測可有效診斷SCC，TTF-1、P40及Ki67聯合檢測可有效診斷SCLC。

作者貢獻：王妍進行文章的構思與設計，撰寫論文；王妍、石芳、劉俊霞、顏晶晶進行研究的實施、資料收集；王妍、石芳進行論文的修訂；王妍、顏晶晶負責文章的質量控制，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。