CYP2C9和VKORC1基因多態性對華法林個體化用藥的指導價值

丁維劍，汪亞南，苗仁華

華法林是維生素K拮抗劑，也稱香豆素類口服抗凝劑，主要用于靜脈血栓栓塞性疾病的一級預防和二級預防。研究表明，華法林預防和治療血栓栓塞性疾病的療效確切且口服給藥便利，是臨床應用較廣泛的一線口服抗凝劑［1］。但華法林治療時間窗較窄，個體差異較大，需頻繁檢測國際標準化比值（international normalized ratio，INR）并實時調整用藥劑量，以權衡治療效果和出血風險，這也是導致華法林臨床使用受限的原因之一［2］。華法林的治療效果受到多種因素的影響，以遺傳因素中基因多態性較為突出［3］。

細胞色素P450 2C亞家族是一類重要的藥物代謝酶，華法林在肝臟中代謝主要依賴細胞色素P450。華法林是S-華法林和R-華法林的光學異構體混合物，其中S-華法林主要由CYP2C9代謝，可以提供華法林70%的抗凝活性［4-5］；同時VKORC1可通過干擾凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成而影響華法林的抗凝作用［6］。因此，CYP2C9和VKORC1基因多態性與華法林的抗凝作用密切相關［7］。

近年隨著藥物基因組學的發展，有大樣本量的全基因組關聯研究（genome wide association study，GWAS）和臨床研究表明，CYP2C9和VKORC1基因在華法林發揮抗凝作用中起主要作用［2，8-10］。華法林藥物基因組學聯合會（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium，IWPC）研究顯示，基于華法林藥物基因組學（包括基因型）構建的藥物基因組學的臨床用藥模型優于基于臨床特征構建的臨床用藥模型［11］。目前，IWPC建立的華法林劑量公益網站（www.warfarindosing.org）［12］會根據患者的基因型和臨床特征（如性別、種族、年齡、身高、體質量、臨床診斷、用藥情況等）自動計算出華法林推薦劑量。基于此，本研究旨在分析CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性對華法林個體用藥的指導價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年6月至2021年6月在安徽醫科大學附屬巢湖醫院藥劑科治療藥物監測實驗室進行CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性檢測的住院患者54例，均為漢族人群，其中男31例（占57.4%），女23例（占42.6%）；年齡（75.5±6.8）歲；身高（163.4±7.8）cm；體質量（61.9±10.2）kg；臨床診斷：冠心病17例（占31.5%），心功能不全16例（占29.6%），心律失常6例（占11.1%），心力衰竭3例（占5.6%），心房顫動2例（占3.7%），腦梗死2例（占3.7%），風濕性心臟病2例（占3.7%），胸悶2例（占3.7%），急性冠脈綜合征1例（占1.8%），心絞痛1例（占1.8%），高血壓1例（占1.8%），頭暈和眩暈1例（占1.8%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性：AA/AA基因型48例（占88.9%），AA/GA基因型4例（占7.4%），AC/AA基因型1例（占1.9%），AA/GG基因型1例（占1.9%）。本研究已通過安徽醫科大學附屬巢湖醫院倫理委員會審核批準。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器：超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司生產，型號：SW-CJ-1FD），旋渦混合器（美國Thermo Fisher生產），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司生產，型號：DK-S22），熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司生產，RT-CyclerTM436/TL998A），臺式低溫離心機（長沙英泰儀器有限公司生產），微量移液槍（芬蘭百得實驗室儀器有限公司生產）。主要試劑：核酸純化試劑（西安天隆科技有限公司生產），測序反應通用試劑盒（西安天隆科技有限公司生產）。

1.3 基因多態性檢測方法

1.3.1 采集血液樣本 采集患者靜脈血1～2 ml，置于含乙二胺四乙酸抗凝劑的紫色采血管，采血前患者無需空腹，可正常飲食。由專人將血液樣本送至治療藥物監測實驗室，4 ℃冰箱保存，24 h內檢測。

1.3.2 從血液樣本中富集白細胞 在1.5 ml離心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl的預處理液，然后加入200 μl混勻的全血，上下顛倒10次，室溫靜置5 min，室溫3 000 r/min離心5 min（離心半徑6.45 cm），之后將上層透明紅色液體吸干凈；加入1 ml 1×NH4Cl的徹底重懸白細胞，離心后將上層液體吸干凈，注意避免吸走管底白細胞。向富集白細胞的離心管中加入30～50 μl核酸純化試劑，反復吹打混勻，室溫靜置20～30 min，期間顛倒混勻2次，待檢測。

1.3.3 上樣 根據待檢測的基因位點，取對應的測序反應通用試劑盒，將樣本編號標注在試劑管蓋上；向相應編號的試劑中加入1.5 μl處理后的白細胞樣本（加樣時應再次混勻，槍頭在管內液體中間吸足1.5 μl樣本，若加入量過少會直接影響結果），蓋緊管蓋，短暫離心后上機檢測。

1.3.4 運行 提前打開熒光檢測儀，軟件為儀器自帶的熒光檢測軟件。儀器進行自檢運行，打開熒光檢測軟件，選擇待檢測的基因位點，設置待檢樣本（注意待檢樣本放入儀器的位置順序與軟件設置的位置順序一致）；放入樣本后開始運行。

1.3.5 結果分析、判讀 運行完成后，軟件“結果”欄給出樣本基因型分析結果。

1.4 華法林治療情況 根據《華法林抗凝治療的中國專家共識》［13］，住院患者口服華法林2～3 d后每日或隔日檢測INR，直到INR達標（根據既往華人的研究結果，以INR為1.5～2.5判定為達標［14-16］）并維持至少2 d，之后可根據患者具體情況數天至1周檢測1次INR，出院后每4周檢測1次INR。根據CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性并參照華法林劑量公益網站計算華法林推薦劑量，以華法林推薦劑量±0.2 mg作為華法林推薦劑量范圍。比較華法林使用劑量為推薦劑量者與華法林使用劑量為非推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達標率。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，計數資料以相對數表示，組間比較采用Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料及基因分型 54例患者于服用華法林2～3 d后檢測INR者23例，其中男14例（占60.9%），女9例（占39.1%）；年齡（75.6±6.5）歲；身高（162.9±8.4）cm；體質量（62.6±12.0）kg；臨床診斷：心功能不全11例（占47.8%），冠心病7例（占30.4%），心律失常2例（占8.7%），心力衰竭1例（占4.3%），心房顫動1例（占4.3%），腦梗死1例（占4.3%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多態性：AA/AA基因型18例（占78.3%），AA/GA基因型3例（占13.0%），AC/AA基因型1例（占4.3%）、AA/GG基因型1例（占4.3%）。

2.2 華法林用藥及INR檢測情況 23例患者中華法林使用劑量為推薦劑量者11例，華法林治療2～3 d后INR達標10例；華法林使用劑量為非推薦劑量者12例，華法林治療2～3 d后INR達標2例。華法林使用劑量為推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達標率高于華法林使用劑量為非推薦劑量者，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 23例患者華法林用藥及INR檢測情況Table 1 Warfarin administration and INR detection in 23 patients

3 討論

本研究結果顯示，54例患者共檢測出4種CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因型，分別為AA/AA基因型48例（占88.9%）、AA/GA基因型4例（占7.4%）、AC/AA基因型1例（占1.9%）、AA/GG基因型1例（占1.9%）。既往研究表明，中原地區漢族和回族人群CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因突變頻率很低，其中攜帶AA/AA基因型的患者占總體的80%～90%，攜帶雜交突變基因型的患者占總體的10%～20%［17-19］，本研究結果與之相似，表明本研究樣本量雖然有限，但具有代表性。

《華法林抗凝治療的中國專家共識》［13］指出，華法林最佳抗凝強度為INR介于2.0～3.0之間，此時出血和血栓栓塞風險均最低，不建議低強度抗凝治療（INR＜2.0），以免增加卒中發生風險。研究表明，在東亞地區，采用低強度華法林治療（INR為1.5～2.5）的患者與采用最佳抗凝強度治療（INR為2.0～3.0）的患者心血管死亡率比較無統計學差異，表明低強度華法林治療較為安全［14］；且該研究結果也在老年心臟機械瓣膜置換術后患者和穩定型冠心病伴心房顫動患者中得到證實［20-21］。TAO等［15］通過人工智能自適應神經模糊推理系統（adaptive neural-based fuzzy inference system，ANFIS）預測個體化華法林的用藥劑量，該研究選取中國15個省份21 863例心臟瓣膜置換術后接受華法林治療的患者為研究對象，通過ANFIS預測患者術后華法林用藥劑量并與國際推薦的INR（2.5～3.5）相比，證實中國人需要更低的抗凝強度（INR為1.5～2.5）。另外，華法林中強度抗凝治療組患者出血事件總發生率高于華法林低強度抗凝治療組，提示華法林低強度抗凝治療有助于預防出血事件，安全性更高［16］。上述研究均表明，華法林低強度抗凝治療可以減少出血發生，且不增加血栓栓塞發生風險。因此，本研究將華法林低強度抗凝治療（INR為1.5～2.5）作為INR達標的判定標準。

參照華法林劑量公益網站計算出的華法林推薦劑量，本組患者華法林使用劑量為推薦劑量者11例，華法林使用劑量為非推薦劑量者12例，提示臨床上仍有很大一部分患者未按照華法林的推薦劑量給藥，且存在劑量調整不規范情況，進而導致INR不達標或達標時間延長。本研究結果顯示，華法林使用劑量為推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達標率高于華法林使用劑量為非推薦劑量者，提示按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性推薦華法林用藥劑量可提高華法林抗凝效果及用藥合理性。此外，臨床上還有一大部分使用華法林治療的患者未進行基因多態性檢測，究其原因可能為基因檢測費用昂貴，患者不愿意檢測。近年來，諸多研究采用IWPC模型計算華法林預測劑量［22-23］，以期減少單純根據臨床經驗進行抗凝治療帶來的弊端、科學指導華法林抗凝治療、降低華法林用藥過量導致的出血風險；但其對中國漢族人群華法林用藥劑量的預測效果有限，故適合中國漢族人群華法林低強度抗凝治療藥物的基因組學模型仍需大規模臨床研究進一步構建。

綜上所述，按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點基因多態性推薦華法林用藥劑量可使患者INR盡快達標，進而提高華法林抗凝效果及用藥合理性。但本研究納入的樣本量較小，基因多態性檢測能否真正為臨床治療提供理論依據還需大規模臨床研究進一步驗證。

作者貢獻：丁維劍進行文章的構思與設計，負責撰寫、修訂論文，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理；丁維劍、苗仁華進行研究的實施與可行性分析，結果分析與解釋；汪亞南進行數據收集、整理、分析。

本文無利益沖突。