辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠氧化/抗氧化失衡的影響

趙華棟 朱勇 魏東陽

(錦州醫科大學附屬第三醫院，遼寧 錦州 121000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣流受限為特征的肺部疾病，其發病機制可能是由肺及全身系統炎癥以及氧化應激機制導致，氣道的炎癥反應與氧化應激密切相關，調節氧化抗氧化平衡在COPD治療中具有重要意義。他汀類藥物已被證實能夠減輕COPD肺部及系統性炎癥反應，但其是否通過抗氧化發揮對COPD保護作用有待進一步研究。本研究通過煙熏法加脂多糖誘導法復制COPD模型，觀察辛伐他汀對COPD大鼠氧化抗氧化失衡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 辛伐他汀(常州九天醫藥公司，生產批號：20070901)；哈德門牌香煙(山東中煙工業公司，焦油含量13 mg，煙堿量為1.2 mg，煙氣一氧化碳量為15 mg)；大鼠吸煙裝置(JY-01型，石家莊綿陽科技開發有限公司，中國)；小動物肺功能儀(Flexivent，加拿大 )；丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)均購自南京建成科技有限公司。健康雄性SD大鼠24只(中國醫科大學動物實驗中心，許可證號1501003)，體重(100±9)g，SPF級飼養，飼料和水嚴格滅菌。

1.2方法

1.2.1分組與模型制作 大鼠經1 w適應喂養后，24只大鼠按隨機數字表法分為3組，每組8只。對照組：第1、15天氣管內滴入生理鹽水0.2 ml，其余時間正常喂養；COPD模型組：第1、15天氣管內滴入脂多糖0.2 ml，將8只大鼠放進大鼠吸煙裝置染毒箱內，箱上端有兩個(1.5 cm×1.5 cm)小孔與外界相通，防止動物缺氧，香煙去掉過濾嘴后插入染毒箱中點燃，關閉染毒箱，1 h后取出大鼠，休息12 h后再重復以上操作1次，連續熏煙5 w，每次熏煙結束后，將COPD模型組置于和對照組相同的環境中喂養飼料。辛伐他汀組：建立COPD模型組方法同上，每次熏煙結束后，給予辛伐他汀灌胃治療(5 mg/kg)，置于相同的環境中喂養。造模成功標準：COPD造模成功大鼠可見氣管、支氣管黏膜上皮纖毛倒伏，部分上皮脫落，杯狀細胞增生，黏膜下層及肌層大量炎癥細胞浸潤，部分腺泡萎縮，血管周圍有炎癥細胞浸潤，肺泡壁斷裂。同時大鼠表現為呼吸急促，不斷搔鼻，煩躁不安。

1.2.2肺功能測定與大鼠肺組織標本采集 實驗第5周，熏煙結束后，記錄各組大鼠體重，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，后仰臥位固定，氣管插管，小動物肺功能儀測定大鼠肺功能指標，包括呼氣峰流速(PEF)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)及FEV1/用力肺活量(FVC)。肺功能檢測結束后通過股動脈緩慢放血處死大鼠，開胸暴露肺和心臟，進行瘀血清理和沖洗，完整取下，利用生理鹽水進行肺血管沖洗，以無菌棉簽分出各個肺葉，肺葉用生理鹽水沖洗后放入冷凍管，置于液氮中儲存處理，另一個肺葉放入裝有甲醛的廣口瓶中。

1.2.3大鼠肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色病理觀察 10%中性甲醛固定大鼠肺組織72 h，脫水、石蠟包埋連續切片，脫蠟至水，蒸餾水浸泡后，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分色浸泡，伊紅溶液染色，乙醇脫色，二甲苯透明。應用中性樹膠封片，置于玻片架上自然烘干，應用顯微鏡(日本Olympus)采集圖片，置于顯微鏡圖像處理系統(中國醫科大學BHEC)下觀察肺組織病理形態并測量：①平均肺內襯間隔(MLI):以視野正中為中心劃十字交叉，計數通過該交叉線的肺泡間隔數，MLI=十字線總長度/肺泡間隔數，其數值反映肺泡平均直徑;②平均肺泡數(MAN):計數各視野內肺泡數，測出各視野面積，平均肺泡數 = 視野內肺泡數/各視野面積，該數值反映肺泡密度。

1.2.4肺組織中MDA、SOD、GSH-Px活性測定 準確稱量肺組織，按10%比例加入冷生理鹽水于玻璃勻漿器中冰上勻漿，勻漿液4℃、4 000 r/min離心10 mim，上清液用考馬斯亮藍法行蛋白定量，取上清液按照試劑盒說明書操作測定以上指標。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組體重比較 各組煙霧暴露實驗開始前體重差異無統計學意義(P>0.05)；暴露實驗結束后，測得COPD模型組及辛伐他汀組體重均顯著低于對照組(P<0.05)；而COPD模型組與辛伐他汀組體重差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組體重、肺功能指標、肺組織病理

2.2各組肺功能指標水平比較 COPD模型組PEF、FEV1和FEV1/FVC均顯著低于對照組(P<0.05)；辛伐他汀組PEF、FEV1和FEV1/FVC均顯著高于COPD模型組,但仍顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.3各組病理學觀察及評分 對照組肺泡及氣管壁輪廓清晰，未見炎癥浸潤。可見正常肺泡間隔，未見肺大泡存在，肺動脈壁無增厚；COPD模型組可見氣管壁有明顯增厚，管腔變窄，氣管壁及周圍有炎性浸潤，肺大泡及肺氣腫可見形成，并且肺動脈壁增厚；辛伐他汀組見氣管壁仍增厚，仍可見肺氣腫，但相較于COPD模型組明顯局限，氣管壁周圍炎癥浸潤減輕，肺泡擴張降低，血管管腔狹窄減輕，見圖1。COPD模型組MLI顯著高于對照組，MAN顯著低于對照組(P<0.05)；辛伐他汀組MLI顯著低于COPD模型組，MAN顯著高于COPD模型組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組肺組織病理變化(HE，×400)

2.4各組肺組織MDA含量、SOD、GSH-Px活性比較 COPD模型組MDA含量顯著高于對照組，而SOD和GSH-Px活性均顯著低于對照組(P<0.05)；辛伐他汀組MDA含量顯著低于COPD模型組,但顯著高于對照組(P<0.05)，辛伐他汀組SOD和GSH-Px活性顯著高于COPD模型組，但顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺組織MDA、SOD、GSH-Px活性水平比較

3 討 論

COPD發病機制尚不完全清楚，目前認為與氣道和肺部慢性炎癥、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化應激等有關，其中氧化應激作為COPD啟動的關鍵因素，包括臭氧、二氧化硫、顆粒物質、過氧化氫及活性氧物質等外源性和內源性氧化物直接或間接損傷氣道和肺部，促進炎癥反應、導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，在COPD發生發展中具有重要作用〔1，2〕。同時在氧化應激損傷中，也可引起脂質過氧化作用，形成MDA，而肺組織則通過強有力的酶性系統(SOD、GSH-Px、過氧化氫酶)和非酶性抗氧化系統使機體減輕氧化應激損傷，改善氧化抗氧化失衡狀態。

本研究結果說明COPD大鼠肺組織抗氧化能力降低，這與既往發現COPD動物模型存在過氧化物酶活性受損的研究結果一致〔3，4〕，而在對COPD患者血清檢測也發現存在著SOD、GSH-Px活性下降〔5〕，以上研究結果與COPD發病機制中存在氧化應激增強及氧化抗氧化失衡的表現一致〔6〕。

前期研究發現辛伐他汀可以減輕COPD大鼠肺組織及全身炎癥反應，改善COPD發生發展及預后〔7〕。辛伐他汀應用于臨床治療COPD急性加重期患者也能夠減輕炎癥反應，提高氧分壓及改善患者肺功能〔8〕。本研究結果說明辛伐他汀可以降低COPD大鼠氧化應激損傷，增強抗氧化能力，改善氧化抗氧化失衡，這可能是辛伐他汀治療COPD的另一作用機制。