LncRNA IGF2-AS基因通過靶向miR-370-3p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

陳天佑 熊飛 張倬 李雪曼

(武漢市第三醫(yī)院胸外科,湖北 武漢 430060)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，每年約有1 800萬(wàn)人被診斷出患有肺癌，大概1 600萬(wàn)人因該疾病而死亡〔1〕。目前，盡管肺癌的臨床治療取得了進(jìn)展，患者的預(yù)后仍然不利，5年生存率約15%〔2〕，總體存活時(shí)間沒有明顯改善〔3〕。因此，迫切需要確定肺癌發(fā)展的潛在機(jī)制，并開發(fā)新的診斷生物標(biāo)志物和治療肺癌的有效策略。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物，盡管大多數(shù)LncRNA的作用機(jī)制仍然未知，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，LncRNA是多種生物過程中的重要調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡等過程〔4，5〕。反義胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2-AS)是LncRNA中的一種，研究發(fā)現(xiàn)IGF2-AS在胃腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)控微小RNA-503(miR-503)影響胃癌的預(yù)后和轉(zhuǎn)移〔6〕。然而，關(guān)于IGF2-AS在肺癌中的表達(dá)及其功能，這方面的資料尚不多見。因此，本研究以肺癌細(xì)胞為對(duì)象，觀察IGF2-AS在肺癌細(xì)胞中表達(dá)情況，利用噻唑藍(lán)(MTT)比色法和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)IGF2-AS對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其下游靶基因miR-370-3p揭示可能的作用機(jī)制，為IGF2-AS在肺癌診斷和治療中的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 人肺癌細(xì)胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，正常肺表皮細(xì)胞HPL-1購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，si-IGF2-AS、pcDNA-IGF2-AS、miR-370-3p、anti-miR-370-3、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海GenePharma公司，MTT、RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自Millipore公司，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K、蛋白激酶B(AKT)和p-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HPL-1、H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，使用胰酶消化、傳代。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)IGF2-AS和miR-370-3p表達(dá) 根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用TRIzol試劑提取H1299細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA為模板，利用ABI 7500 qPCR儀檢測(cè)IGF2-AS和miR-370-3p表達(dá)。IGF2-AS上游引物序列：5′-TGGGAAGTAGGACTAAGGAC-3′，下游：5′-TTGGCTTTGGGCAGATTGAG-3′；miR-370-3p上游引物序列：5′-TGTAACCAGAGAGCGGGATGT-3′，下游：5′-TTTTGGCATAACTAAGGCCGA A-3′。以U6為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算IGF2-AS和miR-370-3p表達(dá)量。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板，細(xì)胞融合度為70%左右時(shí)，通過Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將si-IGF2-AS、pcDNA-IGF2-AS、miR-370-3p、anti-miR-370-3及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集正常培養(yǎng)(NC組)和轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞，胰酶消化，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，并接種于96孔板。培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，將100 μl MTT溶液(5 mg/ml)加入各孔細(xì)胞中，37℃反應(yīng)4 h，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，置37℃搖床震蕩培養(yǎng)10 min，酶標(biāo)儀讀取各孔細(xì)胞的吸光度值OD490 nm值，其中，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡的測(cè)定參照Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行，收集H1299細(xì)胞5×105個(gè)，用500 μl緩沖液懸浮細(xì)胞，吸取Annexin V-FITC 5 μl加入細(xì)胞中，混勻后加入PI 5 μl，混勻，遮光保持10 min，通過流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

1.7Western印跡法檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液從H1299細(xì)胞中提取蛋白。吸取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h，4℃條件下與目的蛋白一抗(稀釋度為1∶1 000)孵育，之后在室溫下與二抗(稀釋度為1∶2 500)孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析CyclinD1、CDK4、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因 通過startbase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)到IGF2-AS與miR-370-3p存在靶向序列。構(gòu)建包含miR-370-3p結(jié)合序列的野生型IGF2-AS(WT-IGF2-AS)、突變型IGF2-AS(MUT-IGF2-AS)的3，非編碼區(qū)域(UTR)熒光素酶報(bào)告基因載體，并與miR-370-3p或miR-con共轉(zhuǎn)染到H1299細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞雙熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IGF2-AS和miR-370-3p在肺癌細(xì)胞系和正常肺表皮細(xì)胞HPL-1中的表達(dá) 與HPL-1細(xì)胞比較，肺癌細(xì)胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446中IGF2-AS表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，miR-370-3p表達(dá)量顯著減少(P<0.05)。見表1。選取IGF2-AS表達(dá)量差異最顯著的H1299細(xì)胞開展后續(xù)研究。

表1 IGF2-AS和miR-370-3p在肺癌細(xì)胞系和正常肺表皮細(xì)胞HPL-1中的表達(dá)

2.2沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞增殖和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染si-IGF2-AS后細(xì)胞中IGF2-AS表達(dá)量顯著低于si-con組(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染有效。同si-con組相比，沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)24 h的細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，而顯著降低48 h、72 h的細(xì)胞活性(P<0.05)。相較于si-con組，沉默IGF2-AS表達(dá)明顯減少CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)量(P<0.05)。見表2，圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)

2.3沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與si-con組比較，沉默IGF2-AS表達(dá)明顯提高H1299細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，顯著降低Bcl-2蛋白水平，顯著增加Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)H1299細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表的影響

2.4IGF2-AS靶向調(diào)控miR-370-3p的表達(dá) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出IGF2-AS與miR-370-3p序列中部分核苷酸可形成互補(bǔ)配對(duì)(圖3)，猜想miR-370-3p可能是IGF2-AS的靶基因之一。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，WT-IGF2-AS的熒光素酶相對(duì)活性被miR-370-3p顯著抑制(P<0.05)，MUT-IGF2-AS的熒光素酶活性不受miR-370-3p影響。qPCR數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染si-IGF2-AS較si-con組明顯提升miR-370-3p表達(dá)量(5.89±0.59 vs 1.00±0.12；P<0.05)，轉(zhuǎn)染pcDNA-IGF2-AS比pcDNA組顯著減少miR-370-3p表達(dá)量(0.32±0.05 vs 0.85±0.09；P<0.05)。

A 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)圖2 沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 IGF2-AS中含有與miR-370-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5抑制miR-370-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用 與si-con組比較，沉默IGF2-AS表達(dá)明顯影響H1299細(xì)胞中miR-370-3p、48h、72h時(shí)的細(xì)胞活性、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。與si-IGF2-AS+anti-miR-con組相比，共轉(zhuǎn)染si-IGF2-AS和anti-miR-370-3p明顯減少H1299細(xì)胞中miR-370-3p表達(dá)量，提高48 h、72 h時(shí)的細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡率，增加CyclinD1、CDK4、Bcl-2蛋白表達(dá)量并抑制Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，上述差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。見表4、圖4。

2.6抑制miR-370-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞中AKT信號(hào)通路的影響 同si-con組相比，沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)PI3K、AKT蛋白水平無(wú)明顯影響，但顯著抑制p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量(P<0.05)。同si-IGF2-AS+anti-miR-con組相比，si-IGF2-AS和anti-miR-370-3p共轉(zhuǎn)染不影響PI3K、AKT蛋白表達(dá)，明顯提高p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)。見表4、圖5。

表4 抑制miR-370-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞增殖、凋亡及AKT信號(hào)通路的影響

1～4：si-con組、si-IGF2-AS組、si-IGF2-AS+anti-miR-con組、si-IGF2-AS+anti-miR-370-3p組；圖5同圖4 Western印跡檢測(cè)肺癌H1299細(xì)胞中CyclinD1、CDK4、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)肺癌H1299細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)

3 討 論

肺癌分為兩個(gè)主要組織學(xué)類別：小細(xì)胞肺癌(占所有肺癌的15%)和非小細(xì)胞肺癌(占所有肺癌的85%)〔7〕。雖然早期發(fā)現(xiàn)肺癌的技術(shù)和策略有所改善，但大多數(shù)肺癌仍在晚期診斷，并且許多肺癌患者缺乏針對(duì)性的治療方案。因此，新型診斷生物標(biāo)志物和治療策略的鑒定是肺癌管理的先決條件。

LncRNA涉及廣泛的生物學(xué)功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等〔8〕。資料顯示，LncRNA在癌癥中起主要作用，腫瘤樣本的全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)鑒定出大量LncRNA與各種類型的癌癥相關(guān)〔9〕。近年來(lái)，LncRNAs被認(rèn)為是惡性腫瘤潛在的診斷和治療工具，包括肺癌在內(nèi)。LncRNA可能表現(xiàn)出腫瘤抑制或促進(jìn)(致癌)功能，影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，如SET結(jié)合因子2反義RNA1(SBF2-AS1)被發(fā)現(xiàn)作為非小細(xì)胞肺癌中的致癌LncRNA〔10〕，含Ⅰ型血小板反應(yīng)蛋白模體的解聚素金屬蛋白酶反義RNA2(ADAMTS9-AS2)作為抑癌因子阻滯肺癌進(jìn)展〔11〕。研究表明，IGF2-AS在肝癌組織中異常表達(dá)，且明顯影響腫瘤數(shù)目、微血管侵犯〔12〕。IGF2-AS參與丙型肝炎病毒的復(fù)制〔13〕，可能充當(dāng)致癌因子的功能，調(diào)控胃腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活動(dòng)〔6〕，也被鑒定為威爾姆腫瘤中的癌癥調(diào)節(jié)劑，抑制IGF2-AS促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)并保護(hù)局部麻醉誘導(dǎo)的脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)毒性〔14〕。在肝癌組織和細(xì)胞中IGF2-AS表達(dá)上調(diào)〔15〕，這與本研究中的結(jié)果一致。敲低IGF2-AS顯著降低肝癌細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞凋亡〔15〕，本研究有同樣發(fā)現(xiàn)提示IGF2AS在肺癌進(jìn)展中可能發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用，與在胃腺癌〔6〕中的功能相同。miRNA參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖〔17，18〕。miR-370-3p在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)會(huì)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖和侵襲〔19〕。miR-370-3p直接抑制Wnt7a表達(dá)，從而抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲〔20〕。miR-370對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔21〕。本實(shí)驗(yàn)中，肺癌細(xì)胞系H1299、A549、SPC-A-1、NCI-H446中miR-370-3p表達(dá)明顯下調(diào)，與相關(guān)研究相符〔19〕。miR-370-3p是LncRNA H19序列中具有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA之一，H19可直接與miR-370-3p結(jié)合，并有效地作為其競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，影響卵巢癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程〔22〕。本項(xiàng)研究中，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出IGF2AS與miR-370-3p具有互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列，雙熒光素酶報(bào)告和qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF2-AS可以靶向調(diào)控miR-370-3p的表達(dá)。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-370-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)肺癌H1299細(xì)胞增殖和凋亡的影響。上述結(jié)果說(shuō)明，靶向調(diào)控miR-370-3p表達(dá)可能是IGF2-AS在肺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。

AKT信號(hào)通路影響肺癌過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等〔23，24〕。沉默IGF2-AS表達(dá)對(duì)磷酸化PI3K和AKT有抑制作用。AKT的活化顯著促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展〔25〕。此外，PI3K參與癌細(xì)胞增殖和凋亡〔26〕。本研究結(jié)果表明IGF2-AS可能通過靶向miR-370-3p調(diào)控AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，IGF2-AS在肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其影響肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制與靶向調(diào)控miR-370-3p表達(dá)并調(diào)控AKT信號(hào)通路有關(guān)，這為肺癌提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。