美膚散對黃褐斑模型小鼠SOD、MDA、TYR、LF和黑色素細胞的影響

王彩霞

(寧夏醫科大學中醫學院，寧夏 銀川 750004)

黃褐斑又稱“肝斑”“黧黑斑”，是一種好發于女性顏面部且治療困難的色素增多性皮膚病〔1〕。皮損為黃褐色或深褐色斑片，常對稱分布于面頰部、顴部，呈蝴蝶形，或累及口、鼻、前額和頦部呈不規則形狀〔2〕。本病病程長，病情頑固，屬難治性皮膚病，對患者生理、心理、精神等方面造成嚴重影響〔3〕。其主要致病因素為內分泌紊亂、日曬、情緒、遺傳、化妝品及長期口服避孕藥等，其他危險因素包括甲狀腺疾病、光毒性藥物、抗癲癇藥物等〔4〕。美膚散為自擬方是寧夏醫科大學附屬回醫(中醫)院中醫美容科外敷治療黃褐斑的經驗用方，臨床應用療效顯著。本研究主要探討美膚散對黃褐斑的治療作用及機制，為其臨床應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1藥物 美膚散組成為丹參、當歸、白附子、僵蠶、黃芪等(均由寧夏醫科大學附屬回醫中醫院中藥房提供)。將上述中藥材清洗干凈，烘干后按照重量配比混合在一起，然后將混合的中草藥研磨成粉末，并將粉末過150～300目篩，收集過篩后的粉末并攪拌均勻，再用鈷60照射滅菌，得到美膚散中藥面膜粉，將其密封保存待用。每次實驗時將美膚散用市售純牛奶調配成1.2 g/ml美膚散混懸液，供小鼠外敷使用。黃體酮注射液：每支10 mg/ml(山西晉新雙鶴藥業有限責任公司)，維生素C注射液(徐州萊恩藥業有限公司)，濃度：0.5 g/2 ml。

1.2動物 C57BL/6J小鼠40只，清潔級，雌性，體重(20±2)g，均由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。

1.3試劑 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂褐質(LF)、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)，酪氨酸酶(TYR)測定試劑盒(由南京建成生物工程有限公司代購)。鼠抗人單克隆抗體HMB45即用型試劑盒(購于福建邁新公司)。

1.4儀器 EB-160/FE紫外燈(美國spectronics公司)，DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(上海將來實驗設備有限公司)，DK-420S型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設備有限公司)，TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)，FL45熒光分光光度計(美國PE公司)，722分光光度計(上海第三分析儀器廠)，ELx808全自動酶標儀(美國佰騰)。

1.5動物分組與造模 將小鼠按數字分組法分為空白組、模型組、陽性對照組(維生素C組)、美膚散組，每組10只。采用黃體酮注射液聯合中波紫外線照射的方法進行造模。實驗前24 h，各組小鼠均用8%硫化鈉(Na2S)水溶液脫去小鼠背部短毛(面積約2.0 cm×2.0 cm)，脫毛后用溫水清洗干凈，實驗期間每周脫毛1次。除空白組外，其余各組均以波長為280～320 nm的中波紫外線(UVB)每日照射小鼠背部皮膚1次，照射時間為1 h，光源距離小鼠20 cm，連續照射30 d。同時，除空白組外，其余各組均肌肉注射黃體酮注射液20 mg/(kg·d)，而空白組肌肉注射滅菌注射用水2 ml/(kg·d)。各組均注射于小鼠大腿根部，每日1次，兩腿交替進行，連續30 d。

1.6給藥方法 造模同時，美膚散組外敷美膚散混懸液，陽性對照組外涂維生素C水溶液，空白組及模型組外涂滅菌注射用水。以上治療每日1次，每次30 min，連續給藥30 d。

1.7生化指標檢測 于第30天末次給藥2 h后將所有小鼠斷頸處死，迅速取其經紫外線照射部位皮膚0.5 g左右，冰浴中制成10%組織勻漿，再將10%勻漿離心，取上清液，并嚴格按照試劑盒提供的方法，測定皮膚和肝臟組織中SOD活性及MDA、酪氨酸酶(TYR)、LF水平。

1.8皮膚黑色素細胞的病理形態學觀察 分別取小鼠照射部位皮膚組織1塊(1 cm×1 cm)，用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋切片后，再經脫蠟至水、抗原修復，用HMB45(黑素瘤)為第一抗體，采用免疫組化技術顯示表皮中的黑素顆粒，觀察黑色素細胞在表皮中的分布及分泌功能情況。

1.9統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1美膚散皮膚組織中黑色素細胞數、TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影響 與空白組比較，模型組皮膚組織中黑色素細胞數目、TYR、MDA及LF含量均顯著增加，SOD顯著降低(P<0.01)，提示造模成功；與模型組比較，美膚散組明顯減少黑色素細胞數目，明顯降低皮膚中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同時提高皮膚中 SOD 活性(P<0.05)，見表1。

表1 各組黑色素細胞數、TYR、MDA、LF含量及SOD活性的影響

2.2美膚散對黃褐斑肝臟組織中TYR、MDA、LF及 SOD 活性的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織中TYR、MDA及LF含量均顯著增加；SOD顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，美膚散組明顯降低皮膚中TYR、MDA及LF含量(P<0.01)，同時顯著提高皮膚中 SOD 活性(P<0.05)，見表1。

3 討 論

黃褐斑是一種臨床上常見的慢性面部色素代謝障礙性皮膚病〔5〕。現代醫學認為，黃褐斑是由人體黑色素生成異常導致，其發病機制非常復雜，可能的相關因素也較多，目前認為人體內分泌失調、紫外線照射、遺傳因素是其主要因素〔4〕。而氧化與抗氧化之間的平衡失調，是黃褐斑公認的主要誘因〔6〕。當機體內脂質過氧化增強，氧自由基生成過量時，體內的SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化物質就會增加，從而清除多余的氧自由基，使機體內氧化與抗氧化處于動態平衡狀態〔7〕。黃褐斑患者體內氧化應激系統大多出現障礙，氧自由基生成過多和抗氧化酶活性降低均可造成生物膜的脂質過氧化，使膜的結構和功能受損而引發黃褐斑〔8〕。因此，抗氧化也是黃褐斑治療的重要機制之一。

黑色素生成過多是黃褐斑形成的根本原因〔4〕。黑色素主要由人體皮膚表皮基底層的黑色素細胞產生，其含量和分布決定了皮膚的顏色〔9〕。但黑色素在基底層的異常蓄積會造成色素沉著過度從而引起黃褐斑、雀斑和老年斑等，嚴重影響人們的生活質量〔10〕。研究表明，TYR在黑色素生物合成中扮演著重要角色，它是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于微生物、動植物及人體中，是酪氨酸和多巴向黑色素轉變過程中的關鍵酶、限速酶，它的活性大小決定著黑色素合成的數量〔11,12〕。因此，通過抑制TYR活性，即可阻斷黑色素生物合成反應鏈，有效防止黑色素的過度沉積，從而起到抑制黃褐斑的作用〔13,14〕。

美膚散為自擬方，是根據黃褐斑的皮損特點，選用具有活血養血、祛斑化瘀、美容養顏、補血消斑功效的中藥組成的復方。本方由丹參、當歸、白附子、僵蠶、黃芪等中藥組成。其中丹參活血祛瘀，養血涼血〔15〕；當歸養血活血，潤澤亮膚〔16〕；白附子解毒散結，增白淡斑〔17〕。僵蠶疏風散熱，駐顏祛斑；黃芪補氣益血，美白潤膚〔18〕。將上述藥物打磨配置后應用于黃褐斑患者，療效顯著。本實驗結果顯示，美膚散局部外敷可降低黃褐斑模型小鼠皮膚和肝臟組織中TYR、MDA及LF含量，增強SOD活性，同時可以明顯減少黃褐斑小鼠皮膚組織中黑色素細胞數目。提示美膚散對黃褐斑模型小鼠具有較好的治療作用，其作用機制可能與抑制黑色素細胞的增殖和TYR的活性，增強機體抗氧化能力有關。