強直性脊柱炎患者T、B及NK淋巴細胞亞群檢測的臨床價值

劉 倩，馬 亮，岳德波，劉 輝，姜永瑋，徐英春

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 檢驗科，北京 100730；2.中日友好醫院 檢驗科，北京 100029；3.中日友好醫院 骨科，北京 100029）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性自身免疫性炎癥疾病，以侵犯骶髂關節、脊柱中軸關節為主。隨著疾病進展可發生脊柱畸形和關節強直，更甚者脊柱硬化無法彎曲而致殘。中國漢族人群AS 患病率約為0.2%～0.3%，并且發病多集中于青壯年男性。AS 的發病機制較為復雜，尚未明確[1]，可能與遺傳、免疫功能、感染及環境等因素相關。研究表明人類白細胞抗原B27（HLA-B27）[2]與AS 的發病密切相關；免疫性疾病常存在T、B、NK 淋巴細胞介導的細胞與體液免疫功能異常[3]，與疾病的發生發展及預后轉歸等密切相關，因此通過檢測AS 患者HLA-B27 基因及分型，以及不同亞型間淋巴細胞亞群分布，在一定程度上可反映出機體細胞、體液等免疫水平。本研究通過分析AS 患者外周血淋巴細胞亞群與疾病之間的關系，初步探討淋巴細胞亞群檢測在AS中的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2018年～2020年中日友好醫院骨科、風濕免疫科等科室確診的121 例AS 患者，及健康對照組120 例。AS 納入標準：符合美國風濕病協會 （American Rheumatology Association，ARA）1984年修訂的紐約標準[4]，臨床資料完備。排除標準：有其他自身免疫性疾病；合并感染性疾病；合并惡性腫瘤等消耗性疾病； 孕期及哺乳期婦女。以上患者或其監護人均簽署知情同意書。

1.2 采血及檢測方法

121 例AS 患者及120 例健康對照人群，均在清晨空腹狀態下采集靜脈血2ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，用于HLA-B27 基因分型及淋巴細胞亞群的檢測。

核酸制備提取： 采用天隆科技公司Ex-DNA全血提取試劑盒按照說明書要求與步驟提取DNA，并且采用Nanodrop1000 微量分光光度計測定每份DNA 的濃度和純度。

HLA-B27 基因分型檢測：采用秀鵬生物技術開發有限公司HLA-B27 基因分型測定試劑盒對上述樣本進行基因分型檢測。PCR 循環參數：96℃2min；96℃20s，68℃1min，循環5 次；96℃20s，65℃50s，72℃45s，循 環10 次；96℃20s，62℃50s，72℃45s，循環15 次；72℃2min。ABI7500 熒光定量PCR 分析儀進行熔解曲線分析，得出HLA-B27 基因分型結果。

淋巴細胞亞群檢測：取3 個樣品測定管，每管中100μl 抗凝全血，加入50μl 熒光標記的單克隆抗體CD3-藻紅蛋白-CY5 耦聯物（CD3-PC5）/CD4-異硫氰酸熒光素（CD4-FITC）/CD8-藻紅蛋白（CD8-PE）、CD5-異硫氰酸熒光素（CD5-FITC）/CD19-藻紅蛋白（CD19-PE）、CD3-異硫氰酸熒光素 （CD3-FITC）/CD16、56-藻紅蛋白（CD16，56-PE），混勻后在室溫下避光孵育30min；加入500μl Optilyse C 全血溶解試劑震蕩，室溫靜置15min；加入稀釋液2.5ml 充分混勻后1500r/min 離心5min，棄上清后加入0.5ml 稀釋液，輕輕混勻后及時進行流式細胞術檢測；Beckman Coulter 流式細胞儀以淋巴細胞設門，檢測熒光標記后的細胞，讀取CD3+（T）%、CD3+CD4+（Th）%、CD3+CD8+（Ts）%、CD19+CD5+（B1）%、CD19+CD5-（B2）%、CD3-CD16+CD56+（NK）%，計算Th/Ts，記錄實驗數據。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以x－±s 表示，采用成組設計t 檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 臨床特征

表1 示，121 例AS 患者，男女比3.2∶1；發病年齡（26.5±11.8）歲，病程（13.8±10.8）年；120 例健康對照人群，男女比3.1∶1。2 組間性別、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。詳見表1。

2.2 HLA-B27 基因及分型檢測

121 例AS 患者HLA-B27 基因 陽性101 例，陰性20 例；101 例HLA-B27 基因陽 性AS 患者中，HLA-B2704 型58 例（57.4%），HLA-B2705 型40 例（39.6%），HLA-B2702 型1 例（1.0%），HLAB2704*HLA-B2705 復合雜合子2 例（2.0%）。120例健康對照人群中HLA-B27 基因陽性3 例（2.5%），其中HLA-B2704 型1 例，HLA-B2705 型2 例；HLA-B27 基因陰性117 例（97.5%）。AS 組HLA-B27 基因陽性率 （83.5%） 顯著高于對照組（2.5%），差異具有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 AS 患者與健康對照人群臨床特征及HLA-B27 基因陽性率比較

2.3 AS 患者與健康對照人群淋巴細胞亞群檢測結果比較

表2 示，與健康對照人群相比，AS 患者CD3+CD8+（Ts）%、CD3-CD16+CD56+（NK）%顯著降低，CD3+CD4+（Th）%、Th/Ts、CD19+CD5+（B1）%、CD19+CD5-（B2）% 顯著升高，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。CD3+（T）% 2 組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 AS 組患者與健康對照組淋巴細胞亞群結果比較（±s）

表2 AS 組患者與健康對照組淋巴細胞亞群結果比較（±s）

注：與健康對照組比較，**P＜0.01。

組別 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%AS 組 121 74.2±7.8 44.7±8.2** 25.3±7.6** 2.0±0.8** 3.0±2.0** 11.3±5.9** 10.7±6.9**健康對照組 120 72.9±10.5 39.9±8.5 33.0±7.5 1.3±0.5 0.9±0.7 7.4±2.7 18.9±8.9

2.4 HLA-B2704、HLA-B2705 型之間AS 患者淋巴細胞亞群檢測結果比較

與HLA-B2704 型AS 患者相比，HLA-B2705型AS 患者T%、Th%、Th/Ts 顯著升高，B1%、NK%顯著降低，差異有統計學意義 （P＜0.01）。2 組Ts%、B2%比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 HLA-B2704、HLA-B2705 型之間AS 患者淋巴細胞亞群結果比較（±s）

表3 HLA-B2704、HLA-B2705 型之間AS 患者淋巴細胞亞群結果比較（±s）

注：與HLA-B2705 型AS 組比較，**P＜0.01。

組別 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%HLA-B2704 58 71.3±6.6** 40.8±7.5** 26.0±7.0 1.7±0.7** 3.5±2.2** 11.3±7.4 13.7±8.0**HLA-B2705 40 78.2±7.2 49.6±5.4 25.0±9.6 2.3±0.9 2.4±2.0 10.7±3.9 6.9±4.6

2.5 HLA-B27 基因陽性與陰性AS 患者淋巴細胞亞群檢測結果比較

HLA-B27 基因陽性與HLA-B27 基因陰性AS 患者T%、Th%、Ts%、Th/Ts、B1%、B2%、NK%差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表4。

表4 HLA-B27 基因陽性與陰性AS 患者淋巴細胞亞群結果比較（±s）

表4 HLA-B27 基因陽性與陰性AS 患者淋巴細胞亞群結果比較（±s）

組別 n T% Th% Ts% Th/Ts B1% B2% NK%HLA-B27 基因陽性 101 74.6±7.6 45.0±7.9 25.6±7.9 2.0±0.8 3.0±2.1 11.1±5.9 10.5±7.3 HLA-B27 基因陰性 20 71.6±9.9 42.8±10.7 23.2±4.9 2.0±1.1 2.7±0.7 12.7±6.1 11.7±2.8

3 討論

AS 患病早期特征較為隱匿，除侵犯中軸關節外，常累及到外周關節及眼部、肺部、心臟、消化系統等。目前AS 病因以及發病機制尚不明確，除了人類白細胞抗原B27（HLA-B27）遺傳假說[2]以外，研究表明免疫功能紊亂[5]可能同樣在AS 的發病機制中發揮重要作用。人體內正常免疫功能依賴于各種免疫細胞之間的協作與制約，淋巴細胞主要包括負責細胞免疫功能的T 細胞和體液免疫功能的B 細胞，以及非特異性免疫功能的NK 細胞。T（CD3+）細胞主要包括Th（CD3+CD4+，輔助性T 細胞）和Ts（CD3+CD8+，抑制性T 細胞），Th 和Ts 細胞相互協調與制約，對維持機體免疫功能穩定起著至關重要的作用；B（CD19+）細胞可分為B1（CD19+CD5+）和B2（CD19+CD5-），B1 細胞一般被歸為固有免疫細胞，可產生多反應性自身抗體，某些致病性自身抗體可能會誘導自身免疫疾病發生，B2細胞可分泌抗體，誘導抗體親和力成熟并分化為漿細胞產生高親和力抗體，參與體液免疫應答；NK （CD3-CD16+CD56+） 細胞是固有免疫細胞，可直接作用于T、B 細胞和分泌細胞因子的方式調節免疫功能，抑制自身反應性B 細胞增殖與分化，發揮免疫監視和早期抗感染作用。因此淋巴細胞亞群[6]的測定有助于了解AS 患者機體免疫狀態及對疾病的監測。

本研究中，AS 患者男女比例約為3.2∶1，發病年齡（26.5±11.8）歲，病程（13.8±10.8）年，與其他流行病學隊列研究結果相符[7]；AS 患者HLA-B27基因陽性率83.5%，以HLA-B2704 型和HLAB2705 型為主，與國內外回顧性研究陽性率和分型結果相一致[8，9]，并且顯著高于健康對照組，證實AS 的發生與HLA-B27 基因呈高度相關[10]。

本次研究中，AS 患者Th%、Th/Ts、B1%、B2%均顯著高于健康人群，Ts%、NK%顯著低于健康人群，T%差異無統計學意義，提示AS 患者免疫功能紊亂，表現為細胞免疫功能失衡，體液免疫功能亢進，并且NK 細胞免疫功能下降，抑制細胞及體液免疫的功能也下降，有可能產生多種自身抗體及細胞因子，進一步導致自身免疫疾病加重，與國內其他研究結果相一致[11～13]，因此T 淋巴細胞亞群的失衡、B 淋巴細胞功能亢進、NK 淋巴細胞免疫監視功能下降，均參與了AS 的發生與發展。

研究還發現，HLA-B2705 型AS 患者T%、Th%、Th/Ts 顯著高于HLA-B2704 型AS 患者，B1%、NK%顯著低于HLA-B2704 型AS 患者，Ts%、B2%差異無統計學意義。故提示我們HLAB2705 型AS 患者細胞免疫失衡程度、NK 細胞下降程度均大于HLA-B2704 型AS 患者；目前對于CD19+B 研究較多，B1 細胞研究相對較少，本研究首次觀察到HLA-B2704 型AS 患者體內B1 細胞增多程度大于HLA-B2705 型AS 患者。

與此同時，我們觀察到HLA-B27 基因陽性與HLA-B27 基因陰性AS 患者T%、Th%、Ts%、Th/Ts、B1%、B2%、NK%差異無統計學意義，可能淋巴細胞亞群分布異常僅與AS 有關，而與是否攜帶HLA-B27 基因無關。雖然目前研究較少，但有文獻[14]報道攜帶HLA-B27 基因的個體有較強的提呈與自身抗原相似的病毒抗原能力，在病毒感染后更容易出現識別自身抗原的細胞毒性T淋巴細胞，造成脊柱細胞損傷，進而引發AS。因本次研究中HLA-B27 基因陰性AS 患者較少，僅有20 例，故待后續研究納入更多病例，再做分析。

綜上所述，AS 的發生與HLA-B27 基因呈高度相關，AS 患者外周血T、B 及NK 淋巴細胞分布異常，免疫功能紊亂，且HLA-B2705 型AS 患者T 及NK 淋巴細胞分布異常程度比HLA-B2704型AS 患者嚴重。因此，HLA-B27 基因分型及淋巴細胞亞群檢測，可以為疾病的發病機制、診斷以及評估患者免疫狀態提供臨床價值。