文冠果幼胚的組織培養和植株再生

張成華 于海燕 秦兆寶

摘要：本文研究了文冠果成熟胚的分生力。結果表明：文冠果幼胚接種在 MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養基上，叢生芽誘導率為83%。繼代增殖在MS+BA0.5mg/+NAA0.11mg培養基上，繁殖系數最高達4倍以上，生根誘導培養基為1/2MS（大量減半）+IBA1.8mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.5g/L，生根率達87%。

關鍵詞：文冠果胚;組織培養;植株再生

文冠果是我國北方重要的木本油料樹種，據資料報道文冠果種子含油率30-60%，種仁含油率55-60%。除種子供醫藥和食用油料外，還可作高級潤滑油、增塑劑、油漆、肥皂等工業原料，近年來亦被認為是一種很有開發潛力的生物能源植物;油餅可提取蛋白質和氨基酸，也可作精飼料;果皮能提取糠醛;葉子可蒸炒加工成茶葉。文冠果也是一種生態優良的綠化觀賞樹種。

文冠果不同種源的種子含油量存在明顯差異，因此對種子含油量高的文冠果種源進行大量繁殖，具有非常廣泛的應用前景。采用組織培養技術是發展大規模、快速繁殖優良文冠果的必然選擇，加速優樹繁殖，提高單位面積產量。

1 文冠果幼胚（非成熟胚）誘導叢生芽的發生

1.1 材料和處理

1.1.1 種源：選用選優的當年采摘的新鮮成熟種子。

1.1.2 種子預處理：將種胚剝離外面的種皮，種子用洗衣粉搓洗3-4次，用溫水洗滌多次，并在溫水中浸泡24小時，然后用單面刀片在外種皮上切一小口，剝開種皮，備用。

1.1.3 種仁消毒處理：將種仁放在超凈工作臺上，打開紫外燈滅菌15min，再用75%乙醇消毒1min，接著把種仁放入0.1%Hgcl2中消毒3.5min，并要輕輕搖動燒杯，以使消毒劑與種仁充分接觸。用無菌水洗滌4次，每次沖洗時間不少于1min，最后用濾紙吸干種仁表面的水分。

1.2 啟動培養基配制

從文冠果幼胚誘導叢生芽，選用MS培養基，摸索細胞分裂素（如BA）和生長素（如NAA）的最佳配比，尋找高誘導率的啟動培養基配方。

1.2.1 啟動培養基配方設計

設計BA和NAA兩個因子，其中BA設計7個濃度水平，NAA設計3個濃度水平。用交叉分組方法設計實驗。每個培養基組方做20瓶，每瓶放入2粒消毒的種仁。

1.2.2 培養條件

接入種仁后的培養瓶（見圖1），放培養室進行培養。溫度控制在20-28℃之間，光照強度為2000-3000LX，每日光照14小時，20d后觀察試驗結果。

1.2.3、實驗結果

在20d培養的時間里，有的幼胚可長出叢生芽，有的幼胚無法誘導出叢生芽，有的幼胚死亡。現將實驗結果列入于下（見表1）

1.2.4、對實驗結果進行方差分析和顯著性檢驗

同一株文冠果樹上結的種子，其基因型都各不相同，因此種子間差異是屬于無法控制、無法預料的隨機因素。而培養基中的BA和NAA兩因素的影響都屬于可控制、可重復的因素。因此在同樣培養條件下，使用同樣配方進行的幾次實驗，可視為重復，它們之間的差異是由隨機誤差所致。

方差分析可以驗證上述實驗設計的正確性。不過，做方差分析時，當因素增加到3個或3個以上時，由于分析計算復雜性大増，所需實驗次數也將以幾何級數增加。因此在方差分析中，3因素及3因素以上方差分析較少用到，一般實驗中多用到2因素方差分析。以下是對BA和NAA兩因素方差所進行的分析。由于BA為0.3、0.5、1.0時，都進行了NAA三個水平實驗。因此，就選擇了兩者相對應的濃度水平進行方差分析。同時由于BA為0.9和1.0時，它們濃度較近，但它們的誘導率差異卻是明顯的。因此，選擇了BA濃度為1.0時做方差分析。

5.32是位于4.46與8.65之間，因此F1達到顯著，而F2僅為0.67，小于4.46，因此F2屬于不顯著。NAA濃度變化對叢生芽誘導試驗的影響不顯著。

該實驗結果，與已知的植物激素生理作用機理相吻合。即有BA促進細胞分裂，組織増大，產生愈傷組織，誘導芽分化等作用;而NAA作用它既影響細胞分裂，伸長和分化，也影響影響營養器官和生殖器官的生長、成熟和衰老。

2 文冠果繼代培育和擴繁

選擇生長旺盛的芽叢做繼代培育（見圖2），但是，繼代培養基不同啟動培養基，所以必須重新進行繼代培養基組方篩選。

將叢生芽生長旺盛的叢苗分割成若干單株，它都能分別進行分化，生長出許多叢生芽。這樣，無異于從一塊“優良”的愈傷組織，可以得到無數的繼代苗，因此也稱之為擴繁。從幼胚分化出的叢生芽具有兩個明顯的優點：一是基型類型多，有利于優良苗木選育;二是容易進行繼代培養。

2.1 繼代苗培養基篩選

繼代培養基配制的原則，基本上與誘導叢生芽培養基相同：以MS為基礎培養基，用交叉分組方法尋找BA和NAA最佳組方。由于是長苗，因此仍要求 BA/NAA的高比值。其觀察比較指標是繁殖系數，即在一代繼代培養中，由一個繁殖單位（如一個芽叢或芽）得到的新苗的個數。

2.2 方差分析

0.79、0.35都小于4.46和8.65，因此FA和FB均屬于不顯著。即把叢生芽塊切割后，只要在培養基中將BA和NAA濃度控制在一定范圍內，基本都能促進芽生長成新苗，但難以區分到底是BA還是NAA對小苗生長的影響更大。根據實驗結果我們發現BA0.4mg/L和NAA0.8mg/L的組合對繼代苗繁殖系數影響最大。

3 文冠果繼代苗生根

將培養高2-3cm的繼代苗，切下轉移到生根培養基上繼續培養，使其長出不定根，形成完整小苗。

3.1 生根培養基篩選

生根培養基組方中，以1/2、1/4、大量元素減半三種MS培養基作為基礎培養基，因此，根據以往經驗，在文冠果幼苗誘導培養基中，只是加入IBA并輔以NAA，誘導繼代苗生根，而不能加入細胞分裂素。同時，試驗了 White、B6培養基，以及1/2 white組方。

在生根培養中，交叉分組方法配制組方。而每一培養基配方重復4次，每次20瓶。生根培養的觀察指標是在15d以內。

3.2 實驗結果

IBA和NAA是兩種化學合成、具有生長素類似效應的植物生長調節劑。雖然它們都具有誘導組培苗生根作用，但是其效應卻并不相同：IBA作用強烈，作用時間長，所誘發的根多而長;而NAA誘發的根少而粗。為此，在實際應用中，它們常搭配使用。但是，在不同物種中，IBA和NAA使用濃度各異，效果也千差萬別。

試驗結果顯示，White、B5以及1/2 white、1/4white配方都很不理想，而實驗結果，基礎培養基以1/2MS、1/4MS與IBA、NAA組合較為理想。

3.3 方差分析

由方差分析可知，4.00是位于3.63和6.23 之間，因此Fa達到顯著;而FB為2.32，小于3.63，因此FB屬于不顯著。即，在IBA和NAA在一定濃度范圍內，IBA的濃度變化對誘導文冠果繼代苗影響顯著，而NAA濃度變化影響不顯著。

在本試驗研究中發現，在誘導文冠果繼代生根時，以NAA為0.5mg/L和IBA為1.8mg/L最為理想（見圖3）。

3.4 用正交設計尋找更佳組方

做正交設計驗證是否IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L是最佳組合。

使用L4（23）正交表做3因子2水平試驗設計

正交設計試驗表明，在上述NAA和IBA最佳配比的各種濃度配合中，繼代苗生根率皆低于IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L配方。為此，可以判斷使用的一系列文冠果繼代苗生根培養基中，該配方為最佳配方。

4 文冠果的組培苗移栽

4.1、馴化煉苗

我們選擇3-5條生根良好的健壯苗，打開瓶蓋，在室溫下馴化鍛煉一周，濕度在50-60%，溫度保持在18-28℃。

4.2、基質準備

將基質經太陽暴曬一天，按照珍珠巖+草碳土=2：8混合均勻，混合時加入殺菌劑進行消毒。

4.3、移栽

取出小苗，去凈根部的培養基，用800倍的百菌清溶液速蘸，ABT1號400ppm生根溶液速蘸進行處理，深栽淺埋，不要握根，栽入營養缽進行培養。移栽后澆少量水，搭上拱形棚，蓋上遮陰網，保持濕度在75-90%，溫度在20-30℃，培養10d左右，根系生長出新的根，葉片增加，慢慢進行通風和去掉遮陰網，進行噴施植物生長調節劑GGR6號10ppm溶液葉面肥料，促使生長健壯，有利于快速出圃。

4.4、移入大田苗圃

1個多月后，小苗長的粗壯、旺盛，移入苗圃可以大田栽種。

用文冠果的幼胚通過不同組方進行快繁培養，實現了良好的繁殖系數，為文冠果大規模化生產提供了可靠的理論和技術服務，同時為我們實現文冠果組培工廠化育苗鋪了一條新路。

參考文獻

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課題項目：“十二五”國家科技支撐計劃“生物質液體燃料資源植物品種選育和豐產栽培技術示范”課題（2011BAD22B08）。

作者簡介：張成華 （1973.10-）、女、漢族、中級農藝師、主要從事植物的組織培養研究與繁育工作27年。