甘藍強骨片治療骨質疏松的藥效學研究

張婷，梁國棟，劉衛東，肖云峰

(1.內蒙古大唐藥業股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區蒙藥新藥研發企業重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010010；3.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，內蒙古 呼和浩特 010010)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身代謝性骨病，表現為骨量減少、骨組織中微細結構被破壞，并伴有骨骼的易脆性、骨折的易患性增加的一種系統性退行性疾病，骨質疏松癥以疼痛劇烈、背部彎曲、體型變矮、骨脆易折為臨床癥狀，由于其發生概率高，危害嚴重，已經引起人們的高度重視[1]。蒙古民族過去是游牧民族，素有“馬背上的民族”之譽稱。由于生活習慣和生活方式的特點，其骨傷、骨折的發生率遠遠高于一般民族。并且其飲食習慣中，蒙古族居民長期大量飲用磚茶飲料食品，磚茶由粗老葉和莖加工而成，含氟量非常高，易造成氟骨癥[2]。氟骨癥主要表現為骨關節病，以骨硬化為主，并伴有骨質疏松和骨間膜改變，形成“地區性骨質疏松”[3]。目前，國內治療此類骨質疏松一般是藥物治療。在藥物療法中，首選是雌激素替代療法，雖然能減少絕經后婦女的骨丟失及骨折發生率，但同時也增加了患乳腺癌和子宮內膜癌的風險[4]。所以開發一類更加安全、有效、可靠的植物類藥已非常迫切了。

骨質疏松屬蒙醫中“骨枯癥”范疇[5]，由于內蒙古獨特的地理和氣候環境孕育了種類繁多的中蒙藥材資源，例如黃芪、甘草和藍刺頭等，都具有豐富的藥理作用[6]，在治療骨質疏松方面具有副作用小等優點[7]。其中藍刺頭具有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用及促進骨形成，對骨吸收、骨形成偶聯有一定調節作用，能降低骨轉換率，以此達到防治骨質疏松的目的[8]。前期研究發現通過將黃芪、藍刺頭等有效部位進行不同配比后，其對大鼠骨質疏松癥有一定的治療作用[9-10]。因此開發出了一種高效低毒的蒙藥復方新藥甘藍強骨片，用于治療由氟骨癥導致的骨質疏松。本實驗通過摘除卵巢建立大鼠骨質疏松模型[11]，考察甘藍強骨片對大鼠骨質疏松模型的治療效果。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物與飼養環境 SPF級Wistar大鼠，內蒙古醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號：SCXK(蒙)2015-0001。

飼養環境：屏障環境；溫度：20～26 ℃，日溫差≤3 ℃；相對濕度：41%～64%；換氣次數：≥15次/h；照明時間：12 h/12 h明暗交替(150～300 Lux)。

1.2 藥品與試劑 甘藍強骨片(內蒙古盛唐國際蒙醫藥研究有限公司，批號:20200324)；地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業有限公司，批號:20190738)；水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠，批號：20181124)；羧甲基纖維素鈉(天津市致遠化學試劑有限公司，批號:20190304)。

1.3 主要儀器設備 電子天平(北京塞多利斯儀器系統有限公司，型號:BS2202S)；實體解剖顯微鏡(德國Leica公司，型號:DFC 290)；雙能X線骨密度儀(美國GE公司，型號:Dexa Pro-1)；精密電子萬能材料試驗機(日本島津公司，型號:AGS-J)。

2 方法

1.1 骨質疏松模型的建立 Wister大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL·(100 g)-1，大鼠麻醉后，俯臥位固定定于手術臺上，在腰背部備皮后，分別用酒精、碘酒對皮膚消毒，沿背部腰椎偏正中線向下切開皮膚2 cm左右，再切開肌肉大約1 cm，打開腹腔，用無菌鑷將卵巢夾出，在子宮角上用3號手術線結扎輸卵管，剪斷輸卵管，提起呈深粉桑葚狀的卵巢，切除卵巢，縫合腹膜切口。用同樣方法操作對側，在切口處撒上青霉素鈉凍干粉后縫合肌肉及皮膚切口，術后肌注2萬單位(U)的青霉素鈉。術后護理大鼠3 d，觀察大鼠狀態，并每天肌注2萬單位(U)的青霉素鈉。

1.2 動物分組與給藥 選取狀態好的50只Wister大鼠隨機將其分為模型對照組、甘藍強骨片0.45、0.90、1.80 g·kg-13個劑量組、雌二醇陽性對照組，另取10只正常大鼠為空白對照組。分組后甘藍強骨片3個劑量組灌胃給予相應濃度的藥物混懸液，20 mL·kg-1，每天1次，連續15 d。陽性對照組每只大鼠皮下注射雌二醇20 ng·d-1，空白和模型對照組灌胃等容積0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 指標采集及檢測

1.3.1 血清生化指標檢測 第15天給藥后30 min，全部大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g。麻醉后，腹主動脈取血。室溫靜置4 h后，3 000 r·min-1離心30 min，分離血清，置-20 ℃冰箱保存。分別按試劑盒說明書上步驟測定血中無機鈣、磷、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.3.2 骨密度測定 取大鼠腰椎和左后肢股骨，仔細剝離附著的肌肉、結締組織，生理鹽水沖洗后，用生理鹽水潤濕后的紗布包裹，置-20 ℃保存。測定骨密度時置于雙能X線骨密度儀下掃描，測量股骨骨密度。

1.3.3 股骨的干重、灰重測定 左肢股骨測完密度后，置于烘箱105 ℃中烘烤1 h后，冷卻、稱量，記錄各組大鼠股骨干重后，將各組標本置于電阻爐中6 h，在干燥器中冷卻至室溫后用電子分析天平測各組灰重。

1.3.4 骨生物力學檢測 將大鼠右側股骨置于萬能力學試驗機中，進行三點彎曲實驗，跨距設置為14 mm，加載速度為2 mm·min-1，測定最大載荷(N)。

3 結果

3.1 甘藍強骨片對血清生化指標的影響 與模型對照組比較，甘藍強骨片0.45、1.8 g·kg-1劑量組大鼠血鈣水平明顯升高(P<0.05)；1.8 g·kg-1劑量組大鼠血磷水平顯著升高，ALP水平顯著降低(P<0.05)，結果如表1所示。

表1 甘藍強骨片對血清生化指標的影響

3.2 甘藍強骨片對股骨密度的影響 與模型對照組比較，甘藍強骨片0.45 g·kg-1劑量組大鼠股骨密度明顯增大(P<0.05)，0.9和1.8 g·kg-1劑量組大鼠股骨密度略有增高，結果如表2所示。

表2 甘藍強骨片對股骨密度的影響

3.3 甘藍強骨片對股骨干重和灰重的影響 與模型對照組比較，甘藍強骨片0.9、1.8 g·kg-1劑量組大鼠股骨干重明顯增加(P<0.05)；甘藍強骨片0.45、0.9、1.8 g·kg-1劑量組大鼠的股骨灰重均明顯增加(P<0.05)，結果如表3所示。

表3 甘藍強骨片對股骨干重和灰重的影響

3.4 甘藍強骨片對骨生物力學的影響 通過測定股骨最大載荷(N)，考察甘藍強骨片對骨生物力學的影響。與模型對照組比較，甘藍強骨片0.45、0.9 g·kg-1劑量組大鼠股骨最大荷載量明顯增強(P<0.05)，1.8 g·kg-1劑量組最大荷載量差異性不具有顯著性，結果如表4所示。

表4 甘藍強骨片對骨生物力學檢測的影響

4 討論

由于骨質疏松是一種在老年女性中發病率最高的慢性骨代謝疾病，尤其是在絕經后，雌激素水平迅速降低導致骨量流失嚴重，更容易出現骨質疏松，因此我們選擇去卵巢大鼠建立骨質疏松模型。而且由于骨質疏松病理機制復雜，因此需要從生化、骨量、骨生物力學多個方面系統地考察甘藍強骨片的藥效學作用，具體包括以下指標：首先，血液中鈣、磷和ALP的含量可以反映骨形成，結果表明甘藍強骨片1.80 g·kg-1劑量組大鼠血清中鈣和磷含量改善最佳；其次，通過測量股骨密度、干重和灰重，可以說明骨量的變化程度，其中骨密度是測量是評價骨質疏松類藥物療效的必要手段，骨密度越大說明骨質量越好。實驗結果顯示甘藍強骨片0.45 g·kg-1劑量組提高股骨密度效果最好，而0.90 g·kg-1劑量組對增加大鼠干重和灰重的效果最佳；最后，檢測股骨的最大載荷可以反映骨強度，分析骨骼的結構力學和材料力學性質。實驗數據顯示甘藍強骨片0.45、0.90 g·kg-1劑量組可以更好地增強股骨的最大載荷。

綜上所述，甘藍強骨片對去卵巢骨質疏松模型大鼠的藥效作用，不同的檢測指標均表明在該實驗條件下甘藍強骨片具有抗骨質疏松的作用，為藥物的進一步開發研究提供數據支持。