高效液相色譜法測定特殊膳食中的煙酸和煙酰胺

李 越，方亞莉

（山西省食品藥品檢驗所，山西太原 030031）

煙酰胺與煙酸統稱為維生素PP，主要存在于動物內臟、肌肉組織中，水果、蛋黃中也有微量存在，在酵母、米糠、麥麩和肉類中含量豐富，是人體必需的13種維生素之一。煙酰胺在體內與核糖、磷酸、腺嘌呤構成輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ，它們是許多脫氫酶的輔酶，在體內生物氧化中起脫氫和加氫作用，與很多代謝過程包括葡萄糖酵解、脂肪代謝、丙酮酸代謝和高能磷酸鍵的生成等有密切關系。煙酸在體內轉化為煙酰胺才能發揮上述作用。此外煙酸還有較強的外周血管擴張作用[1]。人體內煙酸不足時會影響糖的酵解、檸檬酸循環、呼吸鏈以及脂肪酸的生物合成，從而引起煙酸缺乏癥。

目前，煙酸和煙酰胺的檢測方法主要有微生物法[2]、高效液相色譜法[3]。微生物法需在無菌條件下操作，成本較高，檢驗周期長，過程較復雜[4]。本研究結合實驗室現有設施條件，參照GB 5009.89—2016[5]中高效液相色譜法，選擇特殊醫學用途配方食品作為試驗材料，建立了HPLC測定特殊膳食中煙酸和煙酰胺的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌均衡型全營養配方粉；煙酸（來源：中國食品藥品檢定研究院，含量：99.9%）；煙酰胺（來源：SUPELCO，含量：99.9%）；鹽酸；氫氧化鈉；甲醇（色譜純）；異丙醇（色譜純）；庚烷磺酸鈉（優級純）；高氯酸（體積分數為60%）；實驗用水為一級超純水。

1.2 儀器與設備

島津LC-2040高效液相色譜儀、超聲波提取器、OHAUS AR224CN電子天平、OHAUS DV215CD 電子天平和酸度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取混合均勻固體試樣約5.0 g（精確到0.01 g），加入約25 mL 45～50 ℃的水于150 mL錐形瓶中，將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min，充分溶解，靜置5～10 min， 并冷卻至室溫。待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸（5.0 mol/L和0.1 mol/L）調節試樣的pH值至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液（5.0 mol/L和0.1 mol/L）調節試樣溶液的pH值至4.5±0.1。將試樣溶液轉至100 mL容量瓶中，用水反復沖洗錐形瓶，洗液合并于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經濾紙過濾，濾液再經0.45 μm微孔濾膜加壓過濾，用樣品瓶收集，即為試樣待測液。

1.3.2 標準溶液及工作曲線配制

（1）標準儲備溶液。準確稱取煙酸及煙酰胺標準品各 0.01 g，分別置于10 mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成 1.0 mg/mL的標準儲備液。

（2）標準工作系列的制備。分別準確吸取標準儲備液 2 mL至50 mL容量瓶中，用水稀釋定容，配制為40 μg/mL的混合標準中間液。根據檢測需要，將混合標準中間液稀釋配制成濃度為0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL的標準系列工作溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃±0.5 ℃；進樣體積：10 μL；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：檢測波長為261 nm；流動相：甲醇70 mL、異丙醇20 mL、庚烷磺酸鈉1 g，用910 mL水溶解并混勻后，用高氯酸調pH至2.1±0.1，經0.45 μm膜過濾。

2 結果與分析

2.1 線性關系及檢出限

將配制的標準系列工作溶液在上述儀器條件下進行測定，以峰面積Y為縱坐標、待測組分的濃度X為橫坐標，繪制工作曲線，經線性回歸后求得相關系數，結果見表1。取0.03 μg/mL的煙酸標準工作液，0.04 μg/mL的煙酰胺標準工作液，在上述儀器條件下進行測定，由圖譜得信噪比約為3∶1，故煙酸的檢出限為30 μg/100 g，煙酰胺的檢出限為40 μg/100 g。定量限為檢出限的3倍，煙酸和煙酰胺的定量限分別為0.9 mg/kg、1.2 mg/kg。

表1 目標化合物的線性回歸參數及定量限

2.2 方法回收率與重復性

分別稱取樣品5.0 g，加入適量的混合標準溶液，使得樣品中目標化合物的加標濃度如表2中所示。每個濃度進行6次平行試驗，按照前述方法處理并上機測定，計算平均回收率及RSD，結果見表2，目標物的回收率為91%～102%，平均回收率為95%～102%，相對標準偏差均＜20%。

表2 煙酸和煙酰胺加標回收率及重復性試驗結果

2.3 精密度與穩定性試驗

本研究分別考察了7.952 0 μg/mL濃度水平的煙酸和8.519 2 μg/mL濃度水平的煙酰胺，分別在0 h、1 h、2 h、 4 h、6 h和8 h后進樣，計算其RSD，煙酸RSD為0.12%，煙酰胺RSD為0.20%。表明方法精密度與穩定性良好。

3 結論

本研究建立的HPLC測定特殊膳食中煙酸和煙酰胺的方法，目標化合物保留時間相對穩定，線性關系、重復性、回收率、精密度和穩定性等考察結果良好，能夠滿足實驗室對特殊膳食中煙酸和煙酰胺準確、快速、高通量的檢測需求。