前列腺癌組織肝激酶B1，Rab鳥嘌呤核苷酸交換因子-5mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性研究

榮 蓉，古 穎，高 翔，張 磊(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院.檢驗科;.泌尿外科 ,北京 100010)

前列腺癌是男性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年全球發(fā)病患者達(dá)110 萬例，占男性惡性腫瘤的25%[1]。近年來隨著我國人口老齡化，前列腺癌的發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，每年發(fā)病例數(shù)約14.49萬例，死亡例數(shù)約5.17 萬例[2]。目前前列腺癌的治療方法包括根治性手術(shù)治療、輔助內(nèi)分泌治療及紫杉醇類化療等，但由于前列腺癌是一種異質(zhì)性疾病，

許多患者對輔助治療效果不理想，部分患者在內(nèi)分泌治療后出現(xiàn)治療耐藥或抵抗的現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[3]。因此，探索前列腺癌的發(fā)生機制，對于前列腺癌的診斷和治療意義較大。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）編碼基因位于19p13.3，該基因編碼蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的一個成員，參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的極性狀態(tài)[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，

LKB1 在肺腺癌[5]、卵巢癌[6]等惡性腫瘤中存在表達(dá)降低現(xiàn)象，其作為一種抑癌基因，通過抑制下游靶基因AMPKα 的磷酸化激活，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Rab 鳥嘌呤核苷酸交換因子-5 (Rab guanine nucleotide exchange factor-5，RabEX-5) 蛋白位于質(zhì)膜，屬于小GTPase 家族成員，RabEX-5 可以作為鳥嘌呤-核苷酸交換因子，通過與結(jié)合型GDP 作用，使其交換為GTP 激活。據(jù)報道，RabEX-5 作為腫瘤促癌基因，在結(jié)直腸癌[7]、胃癌[8]等許多癌癥中表達(dá)上調(diào)，并與患者的不良生存預(yù)后密切相關(guān)。目前，LKB1 及RabEX-5 在前列腺癌中作用機制和臨床意義尚不明確，本研究通過研究前列腺癌組織中LKB1 及RabEX-5 的表達(dá)，探討兩者在前列腺癌中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選自2017年2月～2018年2月期間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院收治的92 例前列腺癌患者的資料。本研究已獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①由手術(shù)獲取的癌組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查確診為前列腺癌。②初次診治，既往無前列腺疾病病史。③臨床病理和隨訪資料齊全，患者對本研究知情同意并簽字。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其它惡性腫瘤史。②伴心肺功能障礙。③并發(fā)泌尿生殖系統(tǒng)感染。年齡45～75 歲，平均年齡57.32±7.14 歲；平均前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）為26.42±9.41μg/L；腫瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期64 例，Ⅲ期28 例；平均Gleason 評分為8.03±1.15 分；骨轉(zhuǎn)移22 例。以同期首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院行手術(shù)治療的80 例前列腺增生患者作為對照，年齡44～73 歲，平均年齡58.31±6.07 歲，患者既往無惡性腫瘤病史，無放化療等治療病史，經(jīng)病理學(xué)檢查明確為前列腺增生。兩組患者年齡之間無明顯差異（P>0.05）。患者自術(shù)后開始隨訪，以患者來院復(fù)查或電話隨訪的方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止至2021年2月或患者死亡。

1.2 儀器與試劑 PCR 熱循環(huán)儀（賽默飛公司）。實時熒光定量PCR 儀[美國ABI 公司（ABI7500）]。反轉(zhuǎn)錄試劑盒[日本TAKARA 公司（RR037A）]。SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒[上海聯(lián)邁公司（LM-0051）]。PCR引物由上海生工公司設(shè)計合成。

1.3 方法 采用實時熒光定量PCR 檢測組織LKB1，RabEX-5 mRNA 的表達(dá)水平。各取前列腺癌組織和前列腺增生組織約50mg，剪碎后液氮中研缽研磨，12 000r/min 離心5min 后，Trizol 法提取組織中的RNA，以RNA 作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后在實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。引物：LKB1 正向序 列5’-TCCTTGTTTGCTACAGTTTCCTG-3’，反向序列：5’-TCTGGCAGTATTGGGCATTTG-3’，RabEX-5 正向序列5’-TCCAGCAAGTTCAATCAAT GACA-3’，反向序列：5’- TTTTGGCAGGGTTCCT GTAAC-3’，內(nèi)參基因GAPDH 正向序列5’- ACAG GAACCCTGCCAAAAGTA-3’，反向序列:5’CAACA CTGCTAACCTTAGACACA-3’。總體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl，上游和下游引物各0.5μl，cDNA 1μl，8μl ddH2O。 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸34s，變性退火延伸共40 個循環(huán)。LKB1，RabEX-5 mRNA 的表達(dá)水平采用2-ΔΔCt值表示。血清PSA 檢測采用定量測定試劑盒(磁微粒化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以（±s）表示，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。Pearson 線性相關(guān)分析LKB1 與RabEX-5 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性。Kaplan-Meier 生存模型及Log-Rank 檢驗分析LKB1，RabEX-5mRNA表達(dá)與前列腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。多因素COX回歸分析影響前列腺癌患者生存預(yù)后的危險因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和前列腺增生組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá) 前列腺癌組織中LKB1 mRNA 相對表達(dá)量為0.373±0.052，低于前列腺增生組織中的1.234±0.268，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=30.181，P=0.000）；前列腺癌組織中RabEX-5 mRNA 相對表達(dá)量為1.311±0.374，高于前列腺增生組織中的0.457±0.083，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.758，P=0.000）。

2.2 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。Gleason 評分≥7 分、有骨轉(zhuǎn)移和TNM 分期為Ⅲ期的患者LKB1 mRNA 表達(dá)低于Gleason 評分<7 分、無骨轉(zhuǎn)移和TNM 分期為I ～I(xiàn)I 期的患者，而RabEX-5 mRNA 表達(dá)高于Gleason 評分<7 分、無骨轉(zhuǎn)移、TNM 分期為I ～I(xiàn)I期的患者（P<0.05）；不同年齡、PSA 水平的患者LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s，2-ΔΔCt）

表1 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s，2-ΔΔCt）

類 別 n LKB1 t 值 P 值 RabEX-5 t 值 P 值年齡（歲） ＜60 48 0.379±0.060 0.884 0.379 1.294±0.180 0.379 0.705≥60 44 0.367±0.047 1.330±0.151 Gleason評分（分） ＜7 35 0.474±0.091 9.965 0.000 1.184±0.198 2.694 0.008≥7 57 0.311±0.042 1.389±0.125 PSA（μg/L） ＜20 37 0.385±0.073 1.453 0.152 1.283±0.154 0.567 0.572≥20 55 0.365±0.050 1.330±0.141骨轉(zhuǎn)移 有 22 0.313±0.066 6.377 0.000 1.457±0.185 2.419 0.018無70 0.392±0.045 1.265±0.104 TNM 分期 I ～I(xiàn)I 期 64 0.385±0.039 2.490 0.018 1.258±0.179 4.720 0.000Ⅲ期 28 0.345±0.081 1.432±0.116

2.3 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 見圖1。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果表明，前列腺癌組織中LKB1 與RabEX-5 mRNA 表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.402，P=0.000）。

圖1 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

2.4 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)對生存預(yù)后影響 見圖2。92 例患者隨訪3～36 個月，平均隨訪時間為26.36±4.71 個月，隨訪期間死亡28例，失訪3 例。以癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA相對表達(dá)量的均數(shù)0.373，1.311 為臨界值，分為低LKB1 表達(dá)組（n=34）和高LKB1 表達(dá)組（n=55），低RabEX-5 表 達(dá) 組（n=39）和 高RabEX-5 表 達(dá)組（n=50）。低LKB1 表達(dá)組3年總體生存率為35.29%（12/34），高LKB1 表達(dá)組3年總體生存率為89.09%（49/55），低LKB1 表達(dá)組患者3年總體生存率明顯較低（χ2=55.605，P<0.05）。低RabEX-5 表達(dá)組3年總體生存率為89.74%（35/39），高RabEX-5 表達(dá)組3年總體生存率為52.00%（26/50），高RabEX-5 表達(dá)組患者3年總體生存率明顯較低（χ2=29.435，P<0.05）。

圖2 癌組織中LKB1，RabEX-5 mRNA 表達(dá)對生存預(yù)后的影響

2.4 多因素COX 回歸分析影響前列腺癌患者生存預(yù)后的危險因素 見表2。建立COX 比例風(fēng)險回歸模型（全模回歸），以前列腺癌患者生存預(yù)后狀況為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。納入RabEX-5 mRNA 表達(dá)、LKB1 mRNA 表達(dá)及前述表1 中P＜0.10 的指標(biāo)。各變量賦值2.4。回歸結(jié)果表明： Gleason 評分≥7 分、骨轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ期、LKB1 mRNA 低表達(dá)及RabEX-5 mRNA高表達(dá)是影響前列腺癌患者生存預(yù)后的危險因素（均P<0.05）。

表2 多因素COX 回歸分析影響前列腺癌患者生存預(yù)后的危險因素

3 討論

前列腺癌作為男性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性的身體健康。近年來雖然前列腺癌的早期篩查使部分患者得以早期診斷和早期治療[9]，但是臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)一部分男性人群會在激素治療或化療后出現(xiàn)激素抵抗或耐藥，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。此外，部分患者初次診斷時已出現(xiàn)骨、肺等臟器的轉(zhuǎn)移性疾病[10]。因此，深入研究前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵的分子標(biāo)志，對于尋找新的診斷治療靶點，具有重要的臨床意義。

LKB1 是AMPK 途徑中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞分裂[11]。例如，B 細(xì)胞中的LKB1 通過充當(dāng)淋巴細(xì)胞代謝和功能的中央調(diào)節(jié)劑來控制T 細(xì)胞分化和生發(fā)中心的形成[12]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、乳腺癌等多種人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生LKB1 的體細(xì)胞突變的現(xiàn)象，LKB1 表達(dá)失調(diào)參與腫瘤發(fā)生和癌癥發(fā)展的機制非常復(fù)雜，在不同的腫瘤中具有各種信號傳導(dǎo)途徑[13]。本研究中，前列腺癌組織中LKB1 的相對表達(dá)量較低，可能與調(diào)控LKB1 基因表達(dá)的微小RNA 表達(dá)失常有關(guān)。有研究表明，非小細(xì)胞肺癌中LKB1 基因存在突變的現(xiàn)象，LKB1 基因突變導(dǎo)致原癌基因KRAS 過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無限增殖[14]。近年來發(fā)現(xiàn)，腫瘤中LKB1 的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控，如miR-744 能夠直接結(jié)合并降低LKB1mRNA 3UTR 區(qū)，降低mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制LKB1 基因的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果表明癌組織中LKB1 的低表達(dá)促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展過程。LKB1 在多種腫瘤中均發(fā)揮抑癌基因的功能，前列腺癌中LKB1 基因的表達(dá)缺失導(dǎo)致能夠誘導(dǎo)參與細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白（如cyclin D1，增殖性細(xì)胞核抗原等）的水平升高，而導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制的蛋白（如p21）則降低，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[16]。此外，LKB1 的失活與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系已得到越來越多的關(guān)注。LKB1基因表達(dá)缺失后腫瘤細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子及趨化因子，重塑免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。如在非小細(xì)胞肺癌中，LKB1 失活會促進(jìn)CXCL7 和IL-6 的分泌，并招募大量嗜中性白細(xì)胞腫瘤微環(huán)境，抑制T 細(xì)胞浸潤，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[17]。因此，前列腺癌中LKB1 的表達(dá)下調(diào)可能通過抑制免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能起重要作用。

RabEX-5 編碼基因位于人類7 號染色體，RabEX-5 蛋白與rabaptin-5 蛋白結(jié)合形成內(nèi)吞膜融合所需的復(fù)合物，并充當(dāng)Rab5 的特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子。異常的RabEX-5 表達(dá)可能會導(dǎo)致Rab-5 介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡融合過程受阻，從而導(dǎo)致吞噬作用的缺陷。研究數(shù)據(jù)表明，RabEX-5 可作為癌基因，在結(jié)直腸癌和乳腺癌中過表達(dá)，參與惡性腫瘤的形成和發(fā)展，并可影響腫瘤的生物學(xué)行為[7]。然而，目前關(guān)于RabEX-5 在前列腺癌中的作用和作用機理報道較少。在本研究中RabEX-5mRNA 表達(dá)顯著升高，目前其機制尚不清楚，但有學(xué)者報道，RabEX-5 受到體內(nèi)泛素化過程的調(diào)控，即RabEX-5受到泛素化連接酶的調(diào)控，促進(jìn)其降解，而腫瘤發(fā)生時，負(fù)調(diào)控RabEX-5 的泛素化連接酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RabEX-5 積累，進(jìn)而導(dǎo)致Rab-5 介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡融合過程受阻，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞吞噬作用的缺陷，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[18]。此外，本研究結(jié)果表明癌組織中RabEX-5 的高表達(dá)促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展，異常的RabEX-5 高表達(dá)會導(dǎo)致Rab-5介導(dǎo)的內(nèi)吞小泡融合過程受阻，導(dǎo)致吞噬作用的缺陷，作為癌基因參與惡性腫瘤的形成和發(fā)展。此外，RabEX-5 能夠促進(jìn)下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，同時促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由G0 期向G1 期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過度增殖及轉(zhuǎn)移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，結(jié)合以往研究，RabEX-5 本身作為一種E3 泛素化連接酶，介導(dǎo)的Ras 泛素化，促進(jìn)Ras 內(nèi)體定位并抑制ERK 的激活，而LKB1 作為ERK 的下游分子，在RABEX-5 表達(dá)上調(diào)時其表達(dá)也同時受到顯著抑制[20]。

本研究預(yù)后分析顯示LKB1 低表達(dá)與RabEX-5高表達(dá)患者3年總體生存率明顯較低，且多因素COX 回歸分析結(jié)果證實，癌組織LKB1 低表達(dá)與RabEX-5 高表達(dá)是影響前列腺癌患者生存預(yù)后的危險因素，表明LKB1 與RabEX-5 有可能成為預(yù)測前列腺癌患者生存預(yù)后的標(biāo)志物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中LKB1 與RabEX-5 mRNA 表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，分析其原因，可能是兩者在腫瘤的發(fā)生過程中存在負(fù)反饋的調(diào)控機制。研究表明，LKB1 的表達(dá)缺失促進(jìn)RAS 的下游通路過度活化，而RabEX-5 對RAS 的泛素化修飾能夠促進(jìn)RAS 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，抑制其過度活化[21]，因此RabEX-5能對RAS 的過度活化發(fā)揮負(fù)反饋的調(diào)節(jié)功能，但LKB1 與RabEX-5 之間的相互作用關(guān)系及臨床應(yīng)用價值有待深入研究。

綜上所述，前列腺癌組織中LKB1 低表達(dá)，RabEX-5 高表達(dá)，兩者均與腫瘤分期、Gleason 評分、骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，兩者能夠預(yù)測前列腺癌患者的生存預(yù)后，兩者可能參與促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展，有可能成為新的腫瘤標(biāo)志物。