似鲇高原鰍LEAP-2基因序列特征及表達分析

宋明江，陳葉雨，吳曉雲，劉 亞，龔 全，賴見生

(四川省農業科學院水產研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】似鲇高原鰍(Triplophysasiluroides)屬鯉形目(Cypriniformes)，鰍科(Cobitidae)，條鰍亞科(Nemachilinae)，高原鰍屬，主要分布于青海、四川、甘肅的黃河上游[1]。似鲇高原鰍是中國特有的冷水性魚類，對高原環境有著極強的適應性，是體型最大的一種鰍科魚類[2]。似鲇高原鰍是黃河流域的一種重要經濟魚類，近年來，由于非法捕撈及生態環境的惡化，其野生資源量發生了嚴重的下降，已作為易危(vulnerable, VU)物種被列入《中國瀕危動物紅皮書》[3]。近年來, 似鲇高原鰍的人工繁育相繼取得了成功，在一定程度上彌補了種質資源的不足。而在高密度人工繁育過程中，似鲇高原鰍出現疾病頻發、大面積死亡的現象，嚴重威脅其后續育種工作[4]。抗菌肽廣泛分布于上皮細胞表面，能抵御細菌、真菌、病毒及寄生蟲的入侵，同時還具有中和內毒素、趨化免疫細胞、誘導血管生成、免疫調節及傷口修復等其他免疫活性[5]。與抗生素相比，抗菌肽作為一類小分子多肽，有著廣譜的殺菌功能，其直接作用于細菌細胞膜，不會使細菌對其產生抗性[6]。因此，對抗菌肽的研究將在水產養殖疾病控制等領域有著重要的應用價值。【前人研究進展】肝臟表達抗菌肽2 (Liver-Expressed Antimicrobial Peptide-2, LEAP-2)是2003年首次從人類血液中分離的一種新抗菌肽[7]，對革蘭氏陰性、陽性菌具有廣譜抗菌活性。目前，對達氏鱘(Acipenserdabryanus)[8]、金鯧(Trachinotusovatus)[9]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[10]，彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[11]、鮸(Miichthysmiiuy)[12]、鯉魚(CyprinuscarpioL.)[13]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[14]和香魚(Plecoglossusaltivelis)[15]等多種魚類的LEAP-2基因均有相關研究。【本研究切入點】目前，對似鲇高原鰍的研究主要集中于人工養殖技術、地理種群遺傳多樣性分析及分子標記的開發等，對似鲇高原鰍疾病方面的研究僅限于病原微生物的分離，有關抗菌肽及其免疫調控等的研究還處于空白階段。【擬解決的關鍵問題】本研究首次從似鲇高原鰍中分離出LEAP-2基因，分析其序列特征和系統進化的關系，并研究其在健康組織和細菌侵染下的組織表達特征，為似鲇高原鰍抗菌肽的應用和疾病防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用似鲇高原鰍采集于四川巨海漁業科技有限公司養殖基地，所有實驗用魚在處理前均用循環水養殖系統暫養2周。用于組織分布和細菌侵染實驗的魚為人工繁殖的子一代，平均體重24.6 g。攻毒實驗選取的遲緩愛德華氏菌菌株取自四川省農業科學院水產研究所分子實驗室。

1.2 基因序列分析

似鲇高原鰍LEAP-2基因cDNA序列從前期對似鲇高原鰍進行的轉錄組測序數據庫中獲得[16]。基因開放閱讀框ORF使用軟件Vector NTI 10.3.0分析。信號肽預測使用SignalP 5.0在線網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。基因同源性查找及同源基因使用NCBI在線網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行下載。似鲇高原鰍與其余物種LEAP-2相應氨基酸序列的多重比對利用軟件ClustalX進行，序列多重比對圖使用DNAMAN繪制。使用Mega 6軟件中的Neighbor-joining法構建不同物種LEAP-2的進化樹。

1.3 組織表達分析

選取3尾健康的似鲇高原鰍，用于檢測LEAP-2基因的組織分布情況。似鲇高原鰍用MS-222麻醉后，分別分離鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個組織，速凍于液氮，隨后轉移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。總RNA使用TRIzol試劑進行提取，RNA質量通過瓊脂糖凝膠電泳進行初檢，其純度和完整度通過超微量分光光度計進行檢測分析。質量合格的RNA使用Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara, 日本)。

1.4 細菌侵染下LEAP-2基因的表達量檢測

將保存的遲緩愛德華氏菌進行復蘇并培養至生長對數期，調至終濃度為1.6×106CFU/mL，每尾魚注射200 μL的菌液。分別于細菌注射后0，12，24，48，72和96 h共6個時間點采集似鲇高原鰍皮膚、鰓、腸道、腎臟、肝臟和脾臟6個組織進行液氮速凍并保存，每個時間點選取3條魚作為重復。

1.5 實時熒光定量PCR

LEAP-2基因的時空表達通過實時熒光定量PCR進行。PCR擴增體系為20 μL，包括10 μL TB Green Premix ExTaqTMII (Takara, 日本)，4 μL 20倍稀釋后的cDNA模板，上下游特異性引物各1 μL(表1)和4 μL PCR級滅菌水。PCR擴增體系如下：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性5 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環；最終70～95 ℃獲取熔解曲線。內參基因選取β-Actin，采用2-ΔΔCt法計算樣品中LEAP-2基因mRNA的相對表達量，每個樣本重復3次。

1.6 數據分析

在遲緩愛德華氏菌攻毒實驗中，以未注射細菌的個體為對照(0 h)，使用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。基于單因素方差分析基礎上，采用Turkey多重比較法對攻毒組和未攻毒組之間的差異進行檢驗，P< 0.05時為顯著差異。

表1 LEAP-2基因熒光定量PCR檢測所用引物

2 結果與分析

2.1 似鲇高原鰍LEAP-2序列及系統進化分析

似鲇高原鰍LEAP-2cDNA序列為2253 bp，其中5’非編譯區(UTR)為270 bp，3’非編譯區為1698 bp，3’UTR區域有明顯的多聚腺苷酸化信號AATAAA序列(圖1)。開放閱讀框為285 bp，編碼94個氨基酸。信號肽預測結果顯示LEAP-2信號肽包含28個氨基酸殘基。將似鲇高原鰍和其他魚類的LEAP-2氨基酸序列進行比對(圖2)，序列相似性依次如下：西藏高原鰍(Triplophysatibetana, 95.74%)，大鱗泥鰍(Misgurnusmizolepis, 80.85%)，團頭魴(Megalobramaamblycephala, 77.66%)，白甲(Onychostomamacrolepis, 77.66%)，撫仙金線鲃 (Sinocyclocheilusgrahami, 77.66%)，草魚(Ctenopharyngodonidella, 76.60%)，安水金線鲃(S.anshuiensis, 75.53%)，唇(魚骨)(Hemibarbuslabeo, 72.34%)和鯉魚(Cyprinuscarpio, 72.34%)。

采用Mega 6繪制系統進化樹(圖3)，似鲇高原鰍的LEAP-2與西藏高原鰍LEAP-2聚在一支，置信度為99%。似鲇高原鰍與西藏高原鰍LEAP-2與其余魚類LEAP-2基因聚為一個大的分支，而哺乳動物人和小鼠LEAP-2聚在另一分支。

2.2 LEAP-2在不同組織的表達水平

LEAP-2在健康似鲇高原鰍的鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個組織中均有表達(圖4)，但表達水平不一。其中，LEAP-2在似鲇高原鰍肝臟中的表達量最高，是在鰓中表達量的2000多倍。其次為心臟和皮膚，在腦和鰓中表達量最低。

2.3 遲緩愛德華氏菌侵染作用下似鲇高原鰍LEAP-2表達量的變化

在遲緩愛德華氏菌作用下，似鲇高原鰍LEAP-2mRNA表達量在各免疫組織中呈現出不同的變化趨勢(圖5)。在粘膜相關組織皮膚、鰓和腸道中，細菌侵染后48 h，皮膚中的LEAP-2出現顯著上調表達(P<0.05)。侵染72 h后，皮膚、鰓和腸道中的LEAP-2均出現顯著上調表達(P<0.05)。細菌侵染96 h后，鰓組織中的LEAP-2恢復到原始表達水平，而皮膚和腸道中的LEAP-2仍顯著上調表達(P<0.05)。在系統性免疫組織脾臟、肝臟和腎臟中，肝臟中的LEAP-2在細菌侵染24 h時顯著上調表達(P<0.05)，隨后下降。脾臟中LEAP-2先下降表達，隨后在侵染48 h和72 h時顯著上調表達(P<0.05)，在96 h時恢復到正常表達水平。腎臟中的LEAP-2在攻毒96 h上調表達(P<0.05)。

3 討 論

本研究中，在似鲇高原鰍中鑒定出了LEAP-2序列，序列比對表明，該基因與其他魚類的LEAP-2基因序列高度一致。本研究將似鲇高原鰍LEAP-2氨基酸序列在NCBI上進行BLAST檢索分析，發現與其他魚類的LEAP-2同源性在70%以上，說明硬骨魚中LEAP-2序列保守度較高。似鲇高原鰍LEAP-2基因在N端有一個信號肽序列，與其他物種的LEAP-2相同[8, 12-13, 17-19]。成熟肽C末端含有4種保守的半胱氨酸，可以形成2個二硫鍵，這是抗菌肽基因具有抗菌活性的關鍵結構。似鲇高原鰍LEAP-2成熟肽上富含帶正電荷的氨基酸殘基，可與微生物外膜上帶負電荷的基團相互作用[20]。系統進化樹分析結果顯示似鲇高原鰍LEAP-2與其余魚類LEAP-2基因聚為一個大的分支，與西藏高原鰍同源性最高，聚為一小支，進一步證實似鲇高原鰍LEAP-2是其他魚類LEAP-2的同源物。

肝臟幾乎是所有脊椎動物LEAP-2的主要表達組織。在不同水生動物中，LEAP-2的組織表達模式有所不同。例如，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]和中華鱉(Pelodiscussinensis)[22]中的LEAP-2只在肝臟中表達，在其余組織中檢測不到。而虹鱒LEAP-2也在其他組織中誘導表達，如腸組織和皮膚等。在其他物種例如草魚[10]，鮸[12]，團頭魴[14]，香魚[15]，條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[23]和日本鰻鱺(Anguillajaponica)[24]中，LEAP-2轉錄本則存在于多種組織中，包括肝臟、脾臟、頭腎和皮膚，肝臟為表達量最高的組織。在本研究中，LEAP-2轉錄本也普遍表達于似鲇高原鰍各檢測組織，且在肝臟中高表達，高于表達量最低組織2000多倍，與達氏鱘LEAP-2的表達模式相似。研究結果表明，在正常情況下，似鲇高原鰍LEAP-2發揮生物學功能的場所主要集中在肝臟，而不是其他系統性免疫或粘膜免疫組織。

為進一步探索似鲇高原鰍LEAP-2在免疫應答反應中的功能，本研究用遲緩愛德華氏菌對似鲇高原鰍進行侵染，并研究LEAP-2在細菌侵染后的表達模式。研究結果表明，在遲緩愛德華氏菌作用下，各免疫組織中LEAP-2的表達量出現了顯著性變化，且在不同免疫組織中呈現出不同的表達模式。首先，非常值得關注的是，除肝臟LEAP-2在侵染24 h后有小幅度上調表達外，其余時間段肝臟中的LEAP-2表達量與對照組相比都成下降趨勢。肝臟為LEAP-2的主要表達組織，細菌侵染后出現下調表達推測肝臟里的LEAP-2可能轉移至其他免疫組織，用于對抗細菌的侵染。肝臟中LEAP-2受到侵染后的表達模式變化同大鱗泥鰍(Misgurnusmizolepis)類似，其LEAP-2在遲緩愛德華氏菌作用后，也表現出先上升后下降的模式[25]。在粘膜免疫相關組織皮膚、鰓和腸道中，LEAP-2的表達量均出現顯著上升，尤其是腸道組織的變化最為顯著，與對照組相比在侵染后72和96 h后上升了幾十倍，說明腸道在似鲇高原鰍對抗細菌侵染過程中發揮了重要作用。虹鱒LEAP-2在殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida) 作用后，皮膚和腸道中的LEAP-2被誘導表達[21]。在草魚和團頭魴中，細菌誘導后大部分組織中均檢測到LEAP-2表達上調。在其他硬骨魚的不同組織中，在細菌攻毒后也觀察到類似的LEAP-2mRNA水平的上調，因此，LEAP-2被認為有助于防御病原菌的入侵。皮膚、鰓和腸道為魚類主要的粘膜免疫相關組織，細菌侵染后，LEAP-2在該類組織中的顯著性上調表達，提示著似鲇高原鰍LEAP-2在機體粘膜免疫過程中的重要作用。為了充分了解LEAP-2在抵抗病原菌方面的作用，需要進一步通過外源表達獲得重組蛋白，或通過化學合成，研究重組或合成的似鲇高原鰍LEAP-2的體外抗菌活性。

4 結 論

本實驗首次從似鲇高原鰍中分離得到LEAP-2的cDNA序列，得到了其在鰓、腎臟、肝臟、肌肉、胃、腦、腸道、脾臟、皮膚、眼睛和心臟共11個組織的表達情況，并研究了細菌感染下，LEAP-2mRNA在不同組織中的表達狀況，結果顯示似鲇高原鰍LEAP-2參與到了機體對抗細菌侵染的免疫應答反應過程中，為以后似鲇高原鰍LEAP-2的應用奠定了理論基礎。