基于高通量測序的蘋果根腐病病株和健株根際土壤細菌組成與多樣性分析

楊光柱，黃文靜，鄭麗萍，何英云，張 宴，孔寶華，李云國， 趙升文，王順富，李坤明，趙叢艷，李 帆，馬 鈞*

(1.云南省農業科學院園藝作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南農業大學，云南 昆明 650204；3.昭通市蘋果產業發展中心，云南 昭通 657003；4.魯甸縣蘋果產業發展中心，云南 魯甸 657100)

【研究意義】根腐病是一種由多種病原菌復合感染引起的毀滅性病害，是一類導致植物根部腐爛、喪失營養吸收功能的根部病害的總稱。蘋果根腐病主要包括白絹病、紫紋羽病、白紋羽病、圓斑根腐病、頸冠根腐病等幾種類型[1]。蘋果根腐病發生廣泛，在中國陜西省、山西省、河北省、遼寧省等蘋果產區均有發生[2]。近年來，云南省蘋果根腐病發生嚴重，圓斑根腐病發生率為12%～52%[3]。根腐病因病害部位位于地下，發病早期不易察覺，地上部位出現癥狀時，植株根系已大部分腐爛，失去營養吸收功能，常常引起植株整株死亡，因而根腐病往往造成較大的經濟損失，嚴重危害果園健康。根際微生物對植物的生長、營養和健康起著重要的作用[4]，其群落結構及其組成變化能反映土壤的健康狀態，對作物的健康具有重要意義[5]。因此，研究病、健植株根際土壤細菌多樣性，比較根腐病發生前后根際土壤細菌群落結構的變化、探索蘋果根際土壤中有益菌的種類，可以探索根腐病與根際土壤細菌之間的關系，指導我們尋找攻克根腐病的有益細菌，對根腐病生防菌的篩選具有重要意義。【前人研究進展】根際微生物可通過產生植物激素保護植物免受病原菌的侵害、促進植物生長、幫助植物抵抗干旱、溫度等氣候相關環境因素的影響[6]。但同時，在農業生產中，同一地塊的連續使用往往會導致根際微生物中病原菌的積累，從而引起植株的大量死亡[7-8]。對三七根腐病、煙草青枯病等的研究發現，病株根際土壤細菌多樣性和豐富度增加[9-10]。【本研究切入點】根際微生物中有益細菌的減少，有害細菌的增多是土傳病害發生的原因之一。【擬解決的關鍵問題】研究患根腐病植株和健株根際細菌群落及多樣性，明確該地區蘋果根際土壤中有益細菌菌群，為深入研究蘋果根腐病發生的原因、篩選有效促生細菌、生防細菌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

感染根腐病和健康蘋果植株根際土壤樣品于2018年9月采集于云南省昭通市昭陽區灑漁鄉蘋果種植園(27°28' 39" N，103°36' 35" E)，海拔2050 m。果園面積0.53 hm2，樹齡15年，砧木為昭通海棠，品種為紅富士。該果園于2018年春季發現部分植株新生稍枝條較少，葉片變小，夏季整株生長勢較弱。9月，在果園中選擇整株葉片變黃、新生枝條較少、果實提前變黃的病樹，在距離主干30 cm處挖至25～30 cm深，取出表面顏色變棕色、褐色的根系將其表面粘附的土壤抖落在事先滅菌的錫箔紙上，去除植物殘體包好，標記為Disease 1放到液氮中；與病株相隔一株，選取一株葉片健康、新生枝條豐富、長勢健壯且4株相鄰植株均無發病的植株，以同樣的方式采集健康根際土壤，標記為Health 1。在距離病株5株以上的位置，尋找另一癥狀相似的病株，采集患病根際土壤，相隔一株的健康植株采集健康土樣，同樣的方法采集根腐病根際土壤共6份，標記為Disease 1～Disease 6，健康根際土壤6份，標記為Health 1～Health 6。

樣品運回實驗室后，從液氮中取出迅速轉移到-80 ℃冰箱保存，干冰保存送至測序公司提取DNA，進行高通量測序。

1.2 土壤微生物高通量測序

稱取充分混合的土壤樣品1 g，使用美國MP公司Fast DNATMSPIN Kit for Soil試劑盒，按照其操作說明提取樣品DNA。提取DNA后利用瓊脂糖電泳檢測DNA的純度和濃度，用滅菌的超純水稀釋至1 ng/μL保存于-80 ℃以備用。

使用引物 338F/806R (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，以樣品DNA為模板，擴增目標片段的V3～V4 可變區。擴增體系為20 μL(4 μL 5 × Fastpfu Buffer，2 μL 2.5 mmol dNTP，0.8 μL引物338F，0.8 μL引物806R，0.4 μL Fastpfu 聚合酶，0.2 μL BSA，1 μL 20 ng/μL DNA模板)。擴增后取3 μL利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，純化后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行高通量測序。

1.3 數據處理與統計分析

利用FLASH軟件對原始數據進行拼接，將拼接得到的序列進行質量過濾后得到高質量的Tags序列。使用UPARSE軟件(version 7.1)，根據97%相似度對序列進行OTU(operational taxonomic units)聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋，設置置信度閾值為70%，在Silva數據庫中進行比對。通過對樣品Alpha多樣性分析，物種組成分析及差異分析，揭示根腐病蘋果根際細菌群落結構和多樣性的影響。

2 結果與分析

2.1 16s rRNA基因測序深度分析及數據質控

根腐病和健康植株根際土壤2組樣品測序的數據經過過濾、質控、去除嵌合體后，分別得到224 017，230 441條有效序列。每個樣本測得的序列數目不一致，為構建一個數據均衡的樣品序列庫，按最小樣本序列數進行樣本抽平，每個樣品保留31 538條序列用于后續分析。

稀釋曲線(Rarefaction curve，圖1)顯示，所有樣本隨著測序數量的增加，所觀察到的OUT數逐漸趨于平緩，達到飽和，且每個樣本DNA文庫的覆蓋率都在98%以上，說明隨著測序的加深，獲得的新物種不會顯著增加，即測序的數據量合理，能反應樣品的絕大多數的細菌信息。

2.2 蘋果植株根際土壤細菌OTU分類

根據97%相似度對抽平后的序列進行OTU聚類，所有樣品一共得到2526個OTU，其中，根腐病植株根際土壤中檢測到2426個OUT，共鑒定出31個門、70個綱、141個目、279個科、517個屬；健康植株根際土壤中檢測到2463個OUT，鑒定出29個門、65個綱、134個目，270個科、507個屬。Venn圖(圖2)顯示，患根腐病蘋果植株和健康蘋果植株根際土壤共有2163個OTU，根腐病土樣特有260個OTU，健康土樣特有103個OTU。

2.3 蘋果植株根際土壤細菌α-多樣性指數分析

通過生態學中常用來評估群落豐富度的ACE、Chao、Sobs指數，評估樣品群落多樣性的Shannon、Simpson指數等多樣性指數的分析(表1)，評估根腐病和健康蘋果植株根際土壤的Alpha多樣性。結果表明，患病土壤Sobs、ACE、Chao指數極顯著高于健康土壤、Shannon指數顯著高于健康土壤，而物種均勻度指數Simpson指數無顯著性差異。

2.4 蘋果植株根際土壤細菌群落組成和結構分析

對健康和患病根際土壤細菌在不同分類水平進行群落組成分析。在門分類水平，患根腐病及健康植株根際土壤中相對豐度大于1%的細菌組成如圖3，均包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、芽單孢菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)。對2組土壤樣品中優勢細菌門的差異性進行分析，結果表明，健康土樣中放線菌門的相對豐度顯著高于患病土樣(P=0.03)，而酸桿菌門的相對豐度顯著低于患病土樣(P=0.02)，其它門均無顯著性差異。綱分類水平，相對豐度大于0.1%的菌群組成(圖4)，按照豐度從大到小依次是α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)、未知螺旋體菌、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、δ 變形菌綱(Deltaproteobacteria)、藍細菌(Cyanobacteria)、TK10、浮霉菌綱(Planctomycetacia)、熱微菌綱(Thermomicrobia)。對2組土壤樣品中優勢菌綱的差異性進行分析，結果表明，健康土壤Actinobacteria、Thermomicrobia的相對豐度顯著高于患病土壤，而Acidobacteria的相對豐度顯著低于患病土壤、δ 變形菌綱的相對豐度極顯著低于患病土壤。

表1 患根腐病蘋果植株和健康蘋果植株根際土壤細菌α-多樣性

屬分類水平，對2組土樣中相對豐度前50的屬進行差異性分析，結果表明，患病土樣中，Bradyrhizobium(P=0.005)、Bryobacter(P=0.008)、Acidobacteriaceae科Subgroup1細菌(P=0.008)極顯著高于健康土樣，Rhizomicrobium(P=0.013)、JG30-KF-CM66(P=0.037)、Variibacter(P=0.045)顯著高于健康土樣。而Arthrobacter的相對豐度顯著低于健康土樣(P=0.02)。

3 討 論

通過擴增患根腐病和健康蘋果植株根際土壤細菌V3～V4區域，采用Illumina Hiseq高通量測序技術對患病和健康根際土壤細菌的組成和多樣性進行分析，分別獲得224 017，230 441條有效序列，平均長度為433 bp，基本符合V3～V4區域的實際長度，以及所有樣品稀釋曲線隨著測序量的增大，所觀察到的物種數量沒有明顯增加，說明高通量測序方法分析患根腐病和健康根際土壤細菌組成和多樣性具有可行性。

與動物腸道微生物一樣，植物根系微生物對植物的健康具有至關重要的作用[11]。根際微生物可以產生植物激素促進植物的生長，提高植物抵抗病原菌及外界環境變化的能力[12]。然而，微生物結構的變化也可能導致植物根系更容易受到病原菌的侵染[9]。Alpha多樣性分析表明，感染根腐病的蘋果植株根際土壤細菌有更高的群落豐富度和多樣性，前人對三七根腐病、煙草青枯病[9]等的研究也有相同的結果，這可能是由于蘋果感染根腐病后，根系分泌物發生改變等導致的。感染根腐病后，蘋果根系喪失營養吸收功能和分泌根系分泌物的功能，根際營養環境發生改變，導致根際微生物大量繁殖。

Xu等[13]研究發現，全球柑橘根際和非根際微生物中最豐富的門類為變形菌門、放線菌門、酸酐菌門、綠彎菌門等；高秀宏等[14]報道不同地區白樺根際土壤細菌優勢菌為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門，對其它植物根際土壤的研究也顯示相同的優勢菌[15-18]。由此可見，一般情況下，變形菌門、酸酐菌門、放線菌門、綠彎菌門是土壤樣本中含量最為豐度的細菌[19]。研究顯示，蘋果根際土壤與其它植物根際土壤具有相同的優勢菌。患病土壤中，含量最為豐富的菌為變形菌門(38.6%)，其次為放線菌門(16.9%)、酸酐菌門(16.0%)、綠彎菌門；而健康土壤中，含量最為豐富的菌依次為變形菌門(33.9%)，放線菌門(21.8%)、綠彎菌門(11.4%)、酸酐菌門(11.9%)。研究表明，放線菌在提高土壤養分、礦物質的利用率，促進代謝產物的產生和植物生長調節等方面具有重要作用，常常代表土壤的健康狀況[20]；而酸桿菌門則可以作為貧瘠土壤環境的指標[21]，其豐度越低，土壤質量越高[19]。健康土壤中，放線菌的相對豐度顯著高于患病土壤，而酸桿菌門的相對豐度則顯著低于患病土壤。因而推測，相對于感染根腐病的蘋果植株而言，健康的蘋果植株根際土壤具有更好的土壤營養環境，這種營養環境的維持，土壤中的放線菌發揮著重要的作用。對于同一個果園，具有相同施肥和灌溉管理，即相對缺乏空間異質性的土壤來說，造成健康、患病根際土壤營養環境不同的原因還需進一步研究。在綱水平，健康土樣中Thermomicrobia的相對豐度顯著高于患病土壤，而以好氧菌和厭氧菌為主的δ 變形菌綱的相對豐度極顯著低于患病土壤，由于蘋果根腐病多高發于高溫高濕的雨季，因此，可以推測，土壤中更豐富的Thermomicrobia細菌對蘋果根系適應高溫高濕環境更有利。

一直以來，生物防治被認為是控制土傳病害的有效手段，是可持續發展農業實踐的重要研究方向[22]。高通量測序可為探索土著促生微生物提供線索，研究發現，農桿菌屬(Agrobacterium)、節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、固氮菌屬(Azotobacte)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、伯克霍爾德菌(Burkholderia)、柄桿菌屬(Caulobacter)、 色桿菌屬(Chromobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、微球菌屬(Micrococcous)、根瘤菌屬(Rhizobium)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、 沙雷氏菌屬(Serratia)等細菌具有促進植物生長的作用[23-26]，同時，這些植物促生菌也具有抑制不同真菌病原菌的潛力[24]。在患根腐病和健康蘋果植株土壤樣品中，觀察到已報道的促生真菌包括Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium，除健康土壤中Arthrobacter顯著高于患病土壤外(P=0.02)，其它屬無顯著差異。然而，這些菌對蘋果植株是否具有促生作用仍需進一步室內分離、檢測試驗。

4 結 論

根腐病發生后，蘋果根際土壤細菌的多樣性和結構發生改變，其中以放線菌門和酸桿菌門的變化最顯著，放線菌門和酸酐菌門的平衡在蘋果根際土壤健康維持中具有重要作用。蘋果根際土壤中存在Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium等土著促生微生物。研究結果為云南蘋果園有益微生物的研究與應用奠定基礎。