鳳香洗液中“丁香-苦參”配伍干預子宮內膜癌的活性成分及作用機制預測分析

陸小宇,羅 慧,何 鴛,胡鑫潔,周 瑞,朱虹麗,李 楠,陳 梅

(1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽712021；3.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心，陜西 咸陽 712083)

子宮內膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是原發于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內膜腺體的腺癌最常見[1]。EC沒有明確的中醫病名，因其主要癥狀為陰道異常出血、排液、經期延長等，且大多數患者在絕經后發病，因此本病屬中醫“崩漏”“五色帶”“經斷復來”等范疇[2-3]。鳳香洗液是陜西省名中醫賀豐杰教授研發的中藥復方制劑，主要由丁香、苦參、地龍、蛇床子等7味中藥組成，在臨床上被廣泛用于治療陰道炎和宮頸病變，療效較好，且已有臨床實驗研究證明其對于人乳頭瘤病毒感染導致的宮頸上皮內瘤變有抑制作用[4]，基于此本研究探討鳳香洗液對EC的干預機制。網絡藥理學是研究中藥的前沿學科，主要運用網絡學方法分析藥物與疾病、靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系，探討藥物與疾病之間的關系與變化規律，從而闡明中藥活性成分及作用機制，預測中藥作用靶點，為中藥及復方制劑的進一步研究提供依據[5-6]。因此，本研究選用方中丁香-苦參兩味中藥，通過網絡藥理學方法分析預測鳳香洗液干預EC的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究資料 本研究涉及的數據來源及分析平臺主要有中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數據庫、Gene Cards 數據庫、Uniprot 數據庫、OMIM 數據庫、Cytoscape 3.7.2 軟件、Venny 2.1在線平臺、String數據庫、DAVID 數據庫。

1.2 研究方法

1.2.1 丁香-苦參活性成分、靶點收集及網絡構建：以丁香、苦參為關鍵詞通過TCMSP數據庫搜索活性成分，篩選條件為類藥性(Drug like，DL)≥0.18，-2≤脂水分配系數(AlogP)≤4；最終篩選出符合條件的候選活性成分，然后將收集到的靶點在 Uniprot 數據庫中進行規范。利用 Cytoscape 3.7.2 軟件分析活性成分-靶點關聯信息，構建出丁香-苦參活性成分-靶點網絡圖，并分析候選活性成分和靶點間的度值(Degree)。

1.2.2 EC相關靶點收集：以“endometrial cancer”為關鍵詞在Gene Cards 數據庫和OMIM 數據庫中收集EC相關靶點。在 Gene Cards 數據庫中，靶點與疾病之間的相關性與Score值大小成正相關，值越高則代表該靶點與疾病相關性越大，設定Score值大于中位數的目標靶點為潛在疾病靶點[7]，將兩個數據庫收集到的靶點合并刪除重復靶點，最終得到疾病相關靶點。

1.2.3 活性成分-疾病靶點蛋白互作(PPI)網絡構建：將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，使用Venny 2.1在線平臺繪制韋恩圖。將交集靶點導入String數據庫，選擇“Homo sapiens”物種，將“highest confidence”>0.9設定為最小互相作用閾值，構建共同靶點PPI網絡，然后導入Cytoscape 3.7.2 軟件，可視化處理得到 PPI網絡圖。

1.2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析：將丁香-苦參活性成分、疾病共同靶點導入DAVID 數據庫，將Select identifier設定為“Official gene symbol”，限定物種為“Homo sapiens”，List type設定為Gene list，進行GO功能分析和 KEGG 通路富集分析。

1.2.5 活性成分-靶點-信號通路網絡構建：運用 Cytoscape 3.7.2 軟件構建成分-靶點-信號通路網絡圖，分析活性成分及靶點的網絡拓撲參數，并根據網絡拓撲學參數判斷核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 結 果

2.1 丁香-苦參活性成分及靶點的獲取 利用 TCMSP 數據庫篩選得到31個活性成分，其中丁香活性成分6個，苦參活性成分25個，見表1。獲得225個丁香活性成分相應靶點，465個苦參活性成分相應靶點，運用 Cytoscape 3.7.2構建活性成分-靶點網絡圖，圖中深紫色六邊形代表活性成分；淺紫色菱形代表靶點(圖1)。

表1 丁香-苦參主要活性成分

2.2 EC相關靶點的獲取 從 Gene Cards 數據庫獲得EC相關靶點3249個，篩選后得到2754個；檢索OMIM數據庫后補充500個EC相關靶點，合并后刪除重復靶點，最終得到1627個EC相關靶點(圖1)。

2.3 活性成分-疾病靶點 PPI網絡的構建 通過 TCMSP 數據庫共收集31個活性成分，篩選去重后得到203個活性成分靶點，通過韋恩圖將篩選的丁香-苦參活性成分靶點與EC靶點取交集，得到活性成分-疾病共同靶點146個。將共同靶點提交至String數據庫，獲取相互作用關系的網絡，將TSV 文本導入Cytoscape 3.7.2 軟件進行網絡拓撲學分析。結果顯示PPI網絡共包含138個節點，656條邊，根據Degree值>15篩選出27個重要靶點，分別是：AKT1、TP53、TNF、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、ESR1、MAPK8、VEGFA、FOS、RB1、CCND1、EGFR、NR3C1、RXRA、CASP8、INS、NCOA1、IL1B、CXCL8、MYC、CDKN1A、CASP3、IL4、STAT1，提示以上靶點在丁香-苦參干預EC過程具有重要意義(圖2)。

圖2 丁香-苦參干預EC核心靶點PPI網絡

2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析 將從上述研究中篩選得到的核心靶基因導入DAVID數據庫中進行GO功能注釋和KEGG通路富集的分析。GO功能注釋共導出生物過程595個，以P<0.01且Count值≥20為條件進行篩選，得到GO生物過程12個，見表2。說明丁香-苦參可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控等生物過程發揮干預EC的作用。

表2 丁香-苦參活性成分與EC共同靶點GO功能注釋分析表

進一步進行KEGG分析，KEGG的分析共導出通路115條，再按照P<0.01且Count值≥25的條件選擇通路，得到KEGG通路8條，見表3。GO功能注釋和KEGG通路富集分析結果來看，丁香-苦參可能通過癌癥通路、PI3K-Akt信號通路等來發揮干預EC的治療作用。

表3 丁香-苦參活性成分與EC共同靶點KEGG富集分析

2.5 活性成分-靶點-信號通路網絡構建 通過 Cytoscape 3.7.2軟件構建活性成分-靶點-信號通路網絡，網絡共包含 197個節點，1032條邊，綠色的六邊形節點代表藥物的活性成分，深綠色菱形節點代表核心靶點，藍色倒三角節點代表通路；節點的面積代表其度數，節點的重要程度與面積成正相關(圖3)。通過 Cytoscape 3.7.2 內置的Network Analyzer 分析網絡拓撲學參數，得到核心成分及核心作用靶點。槲皮素連接度為107，介度為0.2451，緊密度為0.6049，預測槲皮素為丁香-苦參干預EC的最主要成分，見表4。前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)在網絡中的連接度為30，介度為0.0818，緊密度為0.5065，預測PTGS2為丁香-苦參干預EC的最主要靶點；癌癥通路連接度為54，介度為0.057，緊密度為0.456，預測癌癥通路為丁香-苦參干預EC的最主要通路。

圖3 丁香-苦參活性成分-靶點-信號通路網絡圖

表4 丁香-苦參主要成分網絡節點特征參數

3 討 論

EC在我國女性惡性腫瘤中發病率僅次于宮頸癌，且發病年齡逐漸年輕化，嚴重危害女性生命健康[8]。目前，EC早期多釆用手術聯合化療，晚期或無法手術的患者主要釆取放、化療及激素為主的治療方法，不良反應較多，中醫藥在治療本病方面具有一定優勢[9]。中藥具有多成分、多靶點、多通路的協同調控作用，作用機制復雜多樣，對于多種疾病的防治具有自身的特色和優勢[10-11]。鳳香洗液經過長期臨床實踐和實驗觀察，具有抗腫瘤、抗病毒及殺蟲作用，同時在調節局部免疫方面發揮著重要作用[12]。丁香性溫，味辛，歸脾胃、腎經。現代藥理研究表明，丁香屬植物具有抑制病毒生長、抗菌消炎、抗氧化等作用[13]。丁香所含酚苷類化合物紫丁香苷可以誘導腫瘤細胞的凋亡信號通路，其抗氧化活性能有效減少和對抗自由基的傷害，從而發揮抗腫瘤的功效[14]。苦參性寒，味苦，歸心、肝、胃、大腸和膀胱經。現代藥理學研究發現苦參能增加網狀內皮細胞的吞噬作用，具有殺蟲止癢、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等功效[15]。另外，苦參可通過阻滯腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡和改善腫瘤炎癥微環境等多種途徑發揮抗癌作用[16]。

本研究基于網絡藥理學研究方法，分析鳳香洗液中丁香和苦參兩味中藥干預EC的有效成分、潛在靶點、作用通路及潛在分子機制，為鳳香洗液治療EC提供理論依據。活性成分-靶點-信號通路網絡圖顯示，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚和芒柄花黃素5種活性成分關聯度較高，說明這5種成分可能是丁香-苦參干預EC的關鍵活性成分。丁香-苦參兩味中藥排名第一的活性成分均是槲皮素，槲皮素是廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，其對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，可誘導腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期，調控細胞信號通路，通過抑制腫瘤細胞內多種耐藥相關蛋白的活性及表達，起到逆轉腫瘤細胞耐藥性的作用[17-20]。芹菜素屬于天然的黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學作用[21]。芹菜素可通過PI3K/Akt信號通路激活凋亡蛋白Caspase-3，誘導細胞凋亡，同時下調周期蛋白Cyclin D1、D3和Cdk4阻滯細胞周期，抑制Hela細胞的增殖。芒柄花黃素及其衍生物因具有雌激素活性而發揮有效的抗癌作用。采用芒柄花黃素干預EC細胞HEC-1A荷瘤裸鼠，其通過下調內源性FOXA1、GATA-3蛋白表達維持體內的內分泌平衡從而抑制EC[22]。

活性成分-靶點-信號通路的網絡拓撲屬性分析結果顯示，丁香-苦參干預EC的靶點主要包括前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、AKT1、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、轉錄因子p65(RELA)、絲氨酸蛋白酶(PRSS1)及絲裂原活化蛋白激酶家族成員(MAPK1)等。PTGS2是生成前列腺素的關鍵酶，PTGS2基因的擴增與過表達與炎癥、心血管疾病、某些上皮腫瘤、消化系統良性癌前病變和惡性腫瘤關系密切[23-25]。同時PTGS2基因是包括宮頸癌、乳腺癌、結腸癌等腫瘤疾病易感性和預后的生物標志物[26]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與包括細胞增殖與代謝、周期與轉錄調控等多種生物學過程，并參與炎癥、腫瘤、糖尿病及心血管疾病的發生發展[27]。AKT1在腫瘤細胞的存活與增殖過程中的作用舉足輕重，缺乏AKT1可導致乳腺上皮腫瘤細胞的增殖能力降低，抑制AKT1的表達可誘導肝癌細胞自噬死亡[28-30]。

GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析發現丁香-苦參活性成分主要體現在RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程負調控、信號轉導、細胞增殖的正調控、凋亡過程等生物過程。KEGG通路富集分析顯示主要涉及癌癥信號、PI3K/Akt、乙肝、癌癥蛋白聚糖信號通路等，其中癌癥通路的靶點富集數目最多。PI3K/Akt作為細胞內重要的信號轉導通路之一，介導多種細胞和分子功能，包括細胞的存活、增殖與代謝，多種類型癌癥中均存在此通路的表達失調，其可促進腫瘤的進展和耐藥。PI3K/Akt信號通路在EC的發生發展中起著重要作用，紫草素通過抑制PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化，上調Akt下游靶蛋白Bax或下調Bcl-2誘導EC Ishikawa細胞凋亡，發揮抗EC作用[31]。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法分析得出鳳香洗液中丁香-苦參干預EC的主要活性成分可能是槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚及芒柄花黃素等，并可能通過作用于PTGS2、AKT1、PTGS1、RELA、PRSS1、MAPK1等靶點，調控癌癥、PI3K/Akt及癌癥蛋白聚糖等信號通路抑制腫瘤細胞增殖、阻礙其侵襲與轉移以及逆轉腫瘤的耐藥性等，從而達到干預EC的目的，體現了鳳香洗液多成分-多靶點-多途徑干預EC的特點。本研究結果初步驗證鳳香洗液中丁香-苦參配伍干預EC的作用機制，為后期的實驗研究方向提供了思路與參考。鳳香洗液由7種中藥組成，本文僅對方中丁香-苦參干預EC的主要活性成分及機制進行預測分析，未考慮藥物各成分、化合物之間的相互作用，藥物體內代謝過程及給藥途徑的選擇等因素對結果的影響，因此具有一定的局限性，需要進一步通過藥理和臨床實驗驗證。