白及純化物/氧化魔芋葡甘聚糖胃漂浮片的制備優化與評價

李光英 龍曉燕 許 德 嚴 全 張普香 唐志康

(西南科技大學生命科學與工程學院 四川綿陽 621010)

胃滯留制劑給藥后滯留在胃中，能更有效地治療幽門螺桿菌和潰瘍[1]。鹽酸環丙沙星主要在上消化道吸收，口服后從胃滯留制劑中釋放，增加藥物在胃中的滯留時間可以增加藥物的吸收窗，降低患者的用藥劑量及抗生素耐藥性[2]。

胃滯留給藥系統很大程度取決于凝膠載體材料的結構與性能。魔芋葡甘聚糖(KGM)是魔芋塊莖中提取的高分子水溶性多糖，作為藥物載體材料已有報道[3]。KGM由于分子量大直接運用在載體材料上有限制，因此將KGM進行改性可拓寬其應用范圍。課題組前期研究發現，通過H2O2改性得到的氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)胃漂浮骨架片，其濃度低于10% 時，漂浮時間<12 h；濃度超過10% 時，漂浮時間長達24 h，但24 h累積釋藥率小于90% 不能完全釋藥 ，釋藥性能在漂浮時間內有待提高[4]。白及葡甘聚糖(BSP，BletillaStriatapolysaccharide)為中藥白及糊化淀粉的主要成分，結構和KGM相似，是由葡萄糖和甘露糖形成的雜多糖，具有治療口腔潰瘍和胃潰瘍等消化系統疾病[5]的功效。Kurt等[6]用不同濃度乙醇純化蘭科植物Salep中的葡甘聚糖，從而改善了Salep的純度和流變性能。多糖物理共混的協同作用已有很多報道，李斌[7]綜述了KGM與黃原膠、卡拉膠等物理共混用于彌補單一材料的不足。

在本文中，將兩種結構相似的多糖物理共混，得到新三維空間結構的藥用材料，即白及純化物/氧化魔芋葡甘聚糖復合凝膠載體材料，這種新材料運用于胃滯留給藥緩釋系統鮮見報道。其優勢有：第一，新三維空間的存在可能會產生一個擴展的擴散路徑，這可能會改變釋放特性；第二，提高了BSP在胃內的穩定性；第三，利用BSP具有傷口愈合、止血和抗菌的生物活性，實現BSP 的“藥輔合一”性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

白及中藥飲片，批號：190523，綿陽正和祥藥業有限公司；氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM，實驗室自制，批號：20191108，制備方法見課題組前期發表文獻[3])；無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；鹽酸環丙沙星一水合物(純度>99%)，鄭州阿爾法化工有限公司；3,5-二硝基水楊酸，國藥集團化學試劑有限公司。

HAAKE MARS II型旋轉流變儀，德國Thermo公司；UV-8000S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；RR22GIII 高速冷凍離心機，日立公司；HX-200 型高速中藥粉碎機，浙江永康市溪岸五金藥具廠；ZRS-8G溶出度測試儀，天津市新天光分析儀器技術有限公司；Nicolet-6700紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；TM-300掃描電子顯微鏡(SEM)，德國蔡司儀器公司；SBC7620型濺金儀，英國Emitech；HELEOSII 型多角度激光光散射-凝膠滲透色譜系統，美國Wyatt技術公司。

1.2 方法

1.2.1 白及純化物的制備及其葡甘聚糖含量測定

將白及飲片粉碎，過80目篩，取篩下白及粉(BSF)5 g，按料液比(m/V,g·mL-1)1∶10分別加入到體積分數為30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液中，在室溫下用磁力攪拌器以350 r/min的攪拌速度攪拌洗滌4 h后，離心，取沉淀于45 ℃ 干燥24 h后，得不同白及純化物(BSF)。分別編號為BSF30，BSF40，BSF50，BSF60，BSF70，BSF80。BSF的葡甘聚糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[6]。

1.2.2 白及純化物/氧化魔芋葡甘聚糖-鹽酸環丙沙星胃漂浮片(BGCTs)的制備

分別稱取BSF70粉末、OKGM粉末和OKGM/BSF70混合物粉末2.5 g，加入20 mg/mL的鹽酸環丙沙星水溶液，形成質量分數為10% 的BSF70, OKGM以及OKGM/BSF70鹽酸環丙沙星分散體，攪拌混勻，分別置于模具中，靜置2 h。-70 ℃ 溫度預凍4 h后，真空冷凍干燥24 h，即得BGCTs(注：此藥片與藥劑學上嚴格意義的藥片不同，前者通過冷凍干燥法獲得多孔網絡結構制備得到胃漂浮凝膠片，而后者主要采用壓片法制備)，其制備流程示意圖見圖1。

1.3 結構表征與性能測試

1.3.1 白及純化物流變學測試

將不同濃度乙醇純化所得白及純化物置于80 ℃ 的純水中，制備成2%(m/V)濃度的水溶液，均勻攪拌2 h后，冷卻到室溫進行流變曲線測試。測試條件如下：錐板(Ti60, 1°，直徑60 mm)測試，間距為0.052 mm，測量溫度為25.0±0.05 ℃，每次測試重復3次，剪切速率為1～1 000 s-1[8]。

1.3.2 凝膠滲透色譜(GPC)分析

分別稱量適量OKGM和BSF70粉末，加入10 mL流動相(0.01% NaNO3和0.02% NaN3混合液)，強力攪拌45 min混勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液。精密吸取濾液10 μL，注入多角度激光光散射-凝膠滲透色譜系統(λ=609 nm，T=35 ℃)，測試OKGM和BSF70的絕對分子量及分子量分布。色譜條件如下：流動相：0.01% NaNO3和 0.02% NaN3混合液；流速：0.5 mL/min；色譜柱：SEC Start-up Kit, 300 mm×7.5 mm， dn/dc值為0.140 2。

1.3.3 BGCTs漂浮性能測試

采用體外漂浮法測試BGCTs的漂浮性能：取BSF70粉末、OKGM粉末和OKGM/BSF70混合物粉末制備得到的BGCTs片，置于含有50 mL 的模擬胃液的納氏比色管中。藥片浮出水面所需的時間定義為起漂時間，藥片漂浮的總時間定義為續漂時間[9]。

1.3.4 BGCTs的釋藥性能測試

BGCTs中鹽酸環丙沙星在模擬胃液中的釋放測試采用紫外分光光度法結合《中國藥典》溶出度測定第二法[3, 10]。以500 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液為溶出介質， 轉速為100 r/min，溫度為37 ℃，在1,2,3,4,6,8,10和12 h取樣1 mL(同時補加1 mL等溫模擬胃液)，用0.45 μm微孔濾膜過濾測定吸光度，計算藥物累積釋放率(Accumulate rate, AC)；同時采用綜合評分法(F)評價BGCTs的釋藥性，F按公式(1)計算[11]:

F=|Q2-20%|+|Q6-50%|+|Q12-90%|

(1)

式中：Q2，Q6，Q12分別為2，6，12 h鹽酸環丙沙星的累積釋放率，其標準分別設為20%，50%，90%，F值越小，緩釋效果越好。

1.3.5 BGCTs溶脹性和溶蝕性

取OKGM/BSF70混合物粉末制備得到BGCTs片(稱定質量，記為w0)，置于溶出杯中，加入500 mL 模擬胃液，在溶出度測試儀(轉速100 r/min，溫度37 ℃)中進行處理，間隔一定時間后，取出BGCTs，吸去多余水分，直接稱定BGCTs質量，記為w1；將溶脹和溶蝕處理后的BGCTs樣品干燥至恒重，再次稱定BGCTs質量，記為w2[9]。 按公式(2)和公式(3)計算BGCTs溶脹率和溶蝕率。

(2)

(3)

1.3.6 載藥材料孔隙率測定

(4)

式中：ρ為乙醇密度(g/cm3)。

1.3.7 掃描電鏡(SEM)分析

取供試樣品少許分散在測試臺上，用導電膠帶固定，濺金180 s后，采用掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌，加速電壓為15 kV。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對白及純化物中多糖含量的影響

不同濃度乙醇(乙醇濃度為體積分數，下同)對白及純化物的影響結果如表1所示。BSF30中白及葡甘聚糖的質量分數從原料中的39.50% 顯著性增加到48.75%(p<0.05)。白及葡甘聚糖是白及止血、傷口愈合的主要活性成分[13-14]，故其含量會成為評價白及純化物質量的重要參數。結果表明乙醇處理白及提高了白及純化物的質量。有學者將魔芋粉用40%乙醇在78 ℃ 洗滌4 h，葡甘聚糖質量分數從74% 提高到89%[15]。隨著乙醇濃度從30%增加到80%，白及葡甘聚糖含量呈現先增加后降低的趨勢。當乙醇濃度為70% 時，白及葡甘聚糖質量分數最高為84.88%。低于70%的乙醇濃度，白及葡甘聚糖向上清液相擴散，從而導致溶液黏度增加(通過白及純化物流變學試驗也可以觀察到)，這是由于溶液的介電常數增加，有利于白及葡甘聚糖溶解。乙醇濃度越高，溶液的介電常數越低，白及葡甘聚糖分子的溶解度也越低。另一方面，白及中雜質的溶解度與乙醇濃度成反比，在乙醇濃度70% 時達到最高水平，BSF70的白及葡甘聚糖含量比原料提高了1.15倍。故后續采用BSF70作為制備BGCTs的載體材料。

表1 乙醇濃度對白及葡甘聚糖含量的影響Table 1 Effect of ethanol concentration on Bletillae glucomannan polysaccharide content

2.2 乙醇濃度對白及純化物流變學的影響

不同濃度乙醇純化白及后，白及純化物的剪切應力與剪切速率的關系如圖2所示。隨著剪切速率的增加，白及純化物的剪切應力變大，呈現剪切變稀的現象，即假塑性流體的特性。在相同的剪切速率下，BSF70需要更高的應力。剪切應力的增加是白及葡甘聚糖分子間相互作用增強的結果，這和BSF70的白及葡甘聚糖含量高的結果相一致。

圖2 不同乙醇濃度對白及純化物溶液穩態剪切的影響Fig.2 Effects of different concentration of ethanol on rheological characteristics of purification Bletilla striata

對白及純化物流動曲線采用冪律方程擬合[16]：

(5)

左幅7-1#、7-4#和右幅7-3#已完成樁基澆筑，孔內未發現宏觀裂隙發育。左幅7-2#和右幅7-1#樁基孔尚未開挖。

黏度也是評價中藥白及質量的重要參數[4]。用擬合模型得到的表觀黏度(η100，此處剪切應力為100 s-1)見表2。高分子溶液黏度是分子間作用力及其相互作用的結果。白及葡甘露聚糖鏈間的相互作用經不同乙醇濃度純化后有所增強。乙醇純化處理魔芋精粉也可以提高魔芋精粉中葡甘聚糖的含量，從而提高魔芋精粉的純度[15]。BSF溶液的κ值和n值對純化過程有很強的依賴性。BSF70的稠度系數最大，n值偏離1最遠，BSF70溶液表觀黏度最高。由于BSF70多糖含量最大，白及葡甘聚糖在相對擁擠的空間內其分子鏈的運動變得困難，內摩擦力增大，致使表觀黏度加大。

2.3 BGCTs胃漂浮性能

胃漂浮片漂浮能力會影響其在胃液中的滯留時間，從而影響胃漂浮制劑的性能。OKGM和BSF70以不同質量比共混制備BGCTs，將BGCTs靜置于模擬胃液中，觀察其漂浮性能。實驗結果表明不同BSF70含量的BGCTs片均能立即起漂，添加質量分數20%～80% BSF70可保持BGCTs片的漂浮能力，盡管所有的BGCTs片的靜置續漂時間都超過 6 h，但隨著靜置時間的延長，BGCTs中OKGM和BSF70逐漸溶蝕，導致BSF70含量高的BGCTs的靜置續漂時間降低。當OKGM與BSF70質量比為8∶2時，續漂時間超過 12 h。當BSF70質量分數為100%時，BGCTs靜置于模擬胃液中的續漂時間因BSF70的溶蝕而不能維持到12 h，從而不能持續觀察到其漂浮現象。單獨使用BSF70制備得到的胃漂浮制劑，均不能形成有實際應用價值的胃漂浮片，而只有OKGM的胃漂浮片在靜置續漂過程中溶脹慢，從而使鹽酸環丙沙星從胃漂浮片中釋放不完全[3]，需將OKGM和BSF70共混，從而改善OKGM的釋藥性能。

表2 白及純化物非牛頓流體參數Table 2 Parameters of non-Newtonian fluid of purification Bletilla striata sol

2.4 BGCTs在模擬胃液中的溶蝕性能和溶脹性能

OKGM和BSF70以不同質量比共混，制備得到的胃漂浮片的溶蝕性能結果如圖3所示。OKGM和BSF70按不同質量比共混制備得到的BGCTs，比僅有BSF70的配方溶蝕率有所降低，在模擬胃液中全溶蝕的時間更長，當BSF70質量分數達20% 以上時，BGCTs溶蝕過快，尤其是當BSF70質量分數達80% 時，制備得到的胃漂浮片在6 h內溶蝕率為100%，故不能形成有實際應用價值的胃漂浮片。當BSF70質量分數為20%時制備得到的胃漂浮片，4 h的溶蝕率(42.2%±2.64%)顯著性高于BSF70質量分數為0%的溶蝕率(33.7%±0.06%)(p<0.05)，隨著溶蝕時間延長到6～8 h時，溶蝕率逐漸和不含BSF70的溶蝕率相等；8 h后，溶蝕率反而比不含BSF70的溶蝕率低。實驗結果表明，OKGM與BSF70以質量比8∶2共混制備的BGCTs片劑在酸性介質中其完整性可以合適地保持，適合于胃漂浮片的制備及應用。

圖3 BGCTs 的溶蝕性能Fig.3 Corrosion characteristics of BGCTs in simulated gastric solution

胃漂浮片的溶脹能力和續漂能力都會影響胃漂浮制劑的性能，因為一旦藥片膨脹到無法通過胃幽門的大小，溶脹持續一段時間，就會導致胃潴留時間延長，因此溶脹能力也會受到BGCTs片劑在模擬胃液中的滯留時間的影響[7]。為了證實溶脹性與溶蝕性與BSF70的比例有關，將OKGM和BSF70以不同質量比共混制備得到胃漂浮片，測定其在模擬胃液中的溶脹性能，結果如圖4所示。結果表明，當BSF70的量增加時，溶脹率隨著BSF70比例的增加而下降。OKGM的加入增加了模擬胃液中的溶脹率，這是由于OKGM分子量增加所致。當OKGM質量分數小于20% 時，分子內聚力不足以抵消溶蝕，從而形成蓬松、易碎的凝膠體。因此，由OKGM和BSF70以質量比2∶8共混制備的BGCTs片劑在模擬胃液中只能維持 8 h。當BGCTs片劑在模擬胃液中進行試驗時，每種含有BSF70的BGCTs片劑在模擬胃液中的溶脹率隨著時間的增加而降低，這是由于BGCTs片劑在模擬胃液中的溶脹和溶蝕同時進行所致，僅含OKGM的片劑雖然在模擬胃液中也同時經歷溶脹和溶蝕，但在2 h內溶脹率增加(圖4曲線a)，OKGM胃漂浮片的溶脹率從789%增加到889%，然后隨著時間的增加而降低，可能是OKGM在片劑水合過程中片劑孔隙中的空氣被截留，在凝膠基質中形成氣泡。這些被捕獲的氣泡形成了一個松散而脆弱的結構，這解釋了為什么僅含OKGM的片劑在 2 h 內盡管溶蝕率小但形成的BGCTs片劑非常蓬松，從而出現了鹽酸環丙沙星 2 h的藥物累積釋放率(41.3%±3.2%，圖5曲線a)顯著高于OKGM與BSF70質量比為2∶8的胃漂浮片的藥物累積釋放率(22.8%±3.5%，圖5曲線b)(p<0.05)。

圖4 BGCTs 的溶脹性能Fig.4 Swelling indexes of BGCTs in simulated gastric solution

不同OKGM/BSF70比例的溶蝕率和溶脹率結果證實：加入適當比例的OKGM可協同平衡BGCTs片的溶蝕能力和溶脹能力，OKGM與BSF70質量比為8∶2(見圖3曲線b、圖4曲線b)可協同提高BSF70的溶脹能力。與預期一樣，隨著BGCTs片基質中BSF70含量的降低，BGCTs溶蝕能力有所提升，在模擬胃液中的穩定性提高，在模擬胃液中的漂浮時間更長，緩慢釋藥性能更明顯。因此，mOKGM∶mBSF70=8∶2共混制備得到的BGCTs片，協同平衡BGCTs片的溶蝕能力和溶脹能力，為OKGM/BSF70胃漂浮片克服BSF70在模擬胃液中的藥物突釋奠定了堅實基礎，這也和在模擬胃液中鹽酸環丙沙星的釋放特性結果相一致(圖5曲線b)。

2.5 BGCTs在模擬胃液中的釋藥性能

不同OKGM/BSF70比例制備得到的胃漂浮片在模擬胃液中的藥物釋放性能結果見圖5。單獨使用BSF70制備得到的BGCTs，由于續漂時間過短，在4～6 h內鹽酸環丙沙星釋放率達100%(數據未列出)。當胃漂浮片中BSF70質量分數小于80%，鹽酸環丙沙星釋放速率隨BSF70含量的增加而增加。當mOKGM∶mBSF70=8∶2，即BSF70在體系中的質量分數為20%時，BGCTs在2，6，12 h 累積釋藥分別為22.80%，51.53%，89.05%，鹽酸環丙沙星釋放速率反而比無BSF70緩慢，這是由于BSF70 和 OKGM以 2∶8 的質量比混合，在溶液中互穿形成了更為致密的結構，降低了BGCTs的溶蝕率(圖3曲線b所示)。當BSF70質量分數大于20% 時，內聚力不足以形成致密結構從而形成蓬松的凝膠，導致鹽酸環丙沙星快速釋放。

圖5 BGCTs釋藥行為Fig.5 Drug release behavior from BGCTs

2.6 BGCTs釋藥機制分析

2.6.1 動力學模型擬合分析

為了進一步研究BGCTs在模擬胃液中的藥物釋放機制，分別用以下方程擬合藥物釋放曲線：

零級動力學方程[17]：

Qt=k0t

(6)

一級動力學方程[18]：

ln(1-Qt)=a-k1t

(7)

Higuchi 方程[18]：

Qt=kHt1/2

(8)

Ritger-Pappas方程[18]：

Qt=kptn

(9)

其中:Qt為t時刻藥物累積釋放率;k為相應方程的藥物釋放速率常數;n為Ritger-Pappas方程中藥物釋放因子。對于片劑來說，當n<0.45，藥物以Fick擴散為主的方式釋放；當0.450.89，對應零級動力學方程，藥物主要以骨架溶蝕方式釋放[5,15]。

采用以上4種方程對不同配方比例制備得到的胃漂浮片擬合，參數見表3。其相關系數與一級動力學方程和Higuchi方程擬合度高，BGCTs呈現出緩釋制劑的釋藥特性[15]，尤其以mOKGM∶mBSF70=8∶2 的相關性最高，R2分別為0.992 5和0.998 1，載藥BGCTs緩釋性用Higuchi方程擬合，其相關性更高，顯示出親水性凝膠骨架的緩釋特性[18]，提示鹽酸環丙沙星從BGCTs中釋放以Fick擴散為主。藥物釋放期間是否兼具骨架溶蝕，可用Ritger-Pappas方程擬合鹽酸環丙沙星在模擬胃液中的釋放數據驗證。Ritger-Pappas方程中藥物釋放因子在不同OKGM與BSF70比例制備得到的胃漂浮片中各不相同，除OKGM/BSF70質量比為8∶2，n為0.641 7，在 0.45～0.90 之間外，其余比例的n值都小于0.45。當mOKGM∶mBSF70=8∶2時，載藥BGCTs在模擬胃液中鹽酸環丙沙星的釋放以Fick擴散和骨架溶蝕混合作用的結果為主。不同BSF70和OKGM比例制備的載藥BGCTs在模擬胃液中鹽酸環丙沙星的釋放速率(值)分別為0.308 4,0.162 7,0.299 0,0.346 1,0.374 5,0.462 6，這表明OKGM與BSF70質量比為 8∶2 時的釋放速率緩慢。

表3 BGCTs片鹽酸環丙沙星動力學參數Table 3 Kinetic parameters of ciprofloxacin BGCTs formulations

2.6.2 載藥材料孔隙率分析

OKGM,BSF70以及OKGM/BSF70載體材料孔隙率測定結果見表4。因在BSF70中加入了不同比例的OKGM，使載藥材料的孔隙率從(85.25±0.51)%減少至(77.40±0.50)%。OKGM的添加量影響載藥材料的孔隙率，OKGM的比例越高，載藥材料的孔隙率越小，但當OKGM與BSF70質量比為8∶2至 6∶4 時，載藥材料的孔隙率無顯著性差異(p<0.05)。孔隙率的減小，可以阻擋模擬胃液進入載體材料內部，使目標藥物緩慢釋放。故OKGM和BSF70以一定比例混合，降低孔隙率，是影響BGCTs在胃內滯留的重要基礎。

表4 BGCTs孔隙率(x±s，n=3)Table 4 Porosity of BGCTs(x±s，n=3)

2.6.3 載藥材料SEM分析

OKGM，BSF70 和OKGM/BSF70質量比為8∶2的共混載藥材料的SEM圖都呈現出孔洞結構，如圖6所示。OKGM的微觀結構顯示較小的孔洞和部分不連續的片狀分布，孔隙率也較小，使藥物釋放不完全。BSF70的微觀結構顯示條索狀孔洞結構，孔隙較大，且孔隙率也較大，導致藥物釋放過快。而OKGM與 BSF70 質量比為 8∶2 的共混載藥材料則呈現

圖6 BGCTs 的SEM圖Fig.6 SEM images of BGCTs

膜層片狀孔洞結構，片狀孔洞結構的不規則性和孔隙率的改變說明共混載藥材料之間表現出較強的相互作用，為目標藥物的緩慢釋放提供了基礎。

2.6.4 GPC分析

聚合物的分子量與其性質密切相關，通常用分子量分布(D，Mw/Mn)表示聚合物的分散性能。D值越大，分子量越分散。BSF70和OKGM的重均分子量分別為2.372×105g/mol和8.240×105g/mol，D值分別為1.711和1.334。BSF70和OKGM的重均分子量都在一個數量級內，OKGM分子量較BSF70稍大，分子量分布小，這為共混后分子之間的互穿奠定了基礎。OKGM和BSF70以8∶2質量比混合得到的緩釋載藥材料，在模擬胃液中以Fick擴散和骨架溶蝕協同作用為主，實現了目標藥物在胃內的緩慢釋放。

3 結論

(1) 體積分數70%的乙醇純化得到的白及純化物，其多糖的質量分數可達到84%，其多糖的黏度也最大，分子量為2.372×105g/mol，分子量分布為1.711，其胃漂浮片微觀結構顯示條索狀孔洞結構，孔隙率較小。

(2) OKGM和BSF70按不同質量比混合，制備得到的胃漂浮片劑，都能在模擬胃液中立即起漂；BSF70比例越低，續漂時間越長，當OKGM與BSF70質量比為8∶2時，續漂時間超過12 h。

(3) OKGM和BSF70按質量比8∶2混合，制備得到的載藥胃漂浮片劑在模擬胃液中藥物緩慢釋放，且以Fick擴散和骨架溶蝕協同作用釋放。