HPV16、18、52與宮頸疾病的關聯研究

王虹娟

(山西省中西醫結合醫院， 山西 太原 030013)

宮頸疾病是臨床常見的女性宮頸區域病變，例如宮頸炎、子宮內膜異位、宮頸癌前病變、宮頸癌等[1]。其中宮頸癌是女性各種惡性腫瘤中患病率最多的一種癌癥，影響女性健康生活體驗，大大降低其生活質量水平，嚴重者會威脅生命健康。在發展中國家，宮頸癌發病率和致死率僅低于乳腺癌和肺癌[2]。數據統計分析發現，全球宮頸癌每年新發病例有57萬人次，其中死亡病例占據2/3[1]；我國宮頸癌發病年增長人數約10余萬，占據全球新發病例總數的20%[3]。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)是一種常見嗜黏膜、皮膚的環狀雙鏈DNA乳頭狀病毒，由病毒蛋白外殼和核心DNA構成[4]，HPV感染是宮頸疾病的重要誘因，其持續感染會大大增加宮頸癌發生率。

本研究將宮頸疾病患者作為研究對象，設定HPV16、18、52為考察指標，采用RT-PCR法，分析并研究推測宮頸疾病患者與HPV16、18、52的關聯性，以期為臨床宮頸疾病預防、診斷以及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月～2019年5月山西省中西醫結合醫院婦科住院、門診的宮頸癌、宮頸炎等宮頸疾病患者150例為研究對象，其中宮頸癌患者(宮頸癌組)75例，年齡24～64歲，平均(47.4±19.9)歲；宮頸炎患者(宮頸炎組)75例，年齡20～61歲，平均(36.7±18.8)歲，同期隨機取正常對照組(宮頸正常組)70例，年齡28～60歲，平均(38.6±20.4)歲，共計220例樣本，各組之間一般資料無差異(P>0.05)。

所有宮頸癌患者均已通過組織活檢確診，詳細記錄臨床診斷。本研究已通過醫院倫理委員會審核，且全部患者均對本研究知情同意。按序依次采集所有試驗參加者的宮頸脫落上皮細胞。標本采集后迅速處理，并置于-70℃冰箱保存備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器為實時熒光定量PCR分析儀(ABI-7500，產于美國 ABI 公司)；Thermo Fisher B2生物安全柜(美國 Thermo Fisher公司)，Fresco 17高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)。主要試劑為高危型人乳頭瘤病毒核酸(分型)檢測試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)。

1.3 方法

樣本類型為宮頸脫落細胞。樣本采集時必須為非孕期，溝通告知病人最佳采集時間(備注最佳采集期為婦女絕經前，月經中后期為最佳理想采集時期，切記避開經期)；采集樣本前，叮囑病人檢查前不能涂抹使用任何陰道藥膏，排除因異物造成收集細胞的困難。去掉有子宮切除史或盆腔放療史的樣本；采集樣本前，叮囑強調病人采樣前48 h內禁止性交、盆浴和陰道檢查等活動。

采用一次性宮頸細胞采集器進行樣本采集，具體步驟如下：將檢測專用宮頸刷緩緩伸入，將刷頭輕輕引置于宮頸管內鱗柱上皮交界，刷頭前伸至貼緊宮頸口周圍，沿順時針方向旋轉緩慢轉動十圈以上，禁止反向轉動采樣。旋轉完成后緩慢取出宮頸刷，置于無菌樣本管中，逐一檢查，整理標記復核對應樣本和檢驗申請單標記號碼，用移液槍加2 mL生理鹽水于樣本管中，待檢。采集的標本應立即進行檢測，如暫不檢測，室溫放置應低于24 h，于4℃冰箱冷藏保存時盡量不多于5 d，-20℃冷凍條件下保存不多于7個月，反復凍融低于7 d。

將試劑盒中試劑于室溫放置至室溫相平，渦旋混勻，設置離心條件為10 000 r/min，離心20 s后備用。分別精密吸取人乳頭瘤病毒(16、18、33、39)、人乳頭瘤病毒(45、59、35、66)、人乳頭瘤病毒(51、52、53、68)、人乳頭瘤病毒(31、56、58、β-球蛋白) PCR 反應液n×38 μL 分別與4份n×2 μL 酶混合液(n=待檢樣本數+質控品2個)，充分混勻制成PCR反應液，同樣條件下再次離心20 s，備用。

將無菌樣本管中的樣本置于漩渦振蕩器中，充分震蕩洗脫2～3 min，分別移至預先備好的兩支滅菌離心管中，一支用于留樣復檢，一支用于待測。取其中一份樣本，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，離心管底部沉渣加入100ml生理鹽水，充分吹打混勻、備用。準備一支新的滅菌離心管，吸取預處理后的樣本25 μL并同時加入25 μL核酸釋放劑，充分吹打混勻，作為待測樣本備用。吸取25 μL陰性對照、陽性對照，分別與25 μL核酸釋放劑吸打混勻，待用。將每個PCR反應管中加入上述處理好的待測樣本、陰性對照、陽性對照各10 μL，重復4次，注意吸取不同樣本時必須更換吸頭，加樣結束后，室溫靜置10 min以上，將40 μL上述已配制好的4種PCR混合液分別對應加入4個反應管，蓋上管蓋，輕輕渦旋后待測。

將上述加好樣的PCR八聯管放置于PCR擴增儀樣品槽中，按照加樣順序依次分別設置并標注樣本名稱為陰性對照、陽性對照以及各待測樣本。選擇FAM通道，檢測人乳頭瘤病毒16、45、51、56-DNA；選擇HEX或VIC 通道檢測人乳頭瘤病毒18、53、58、59-DNA 選擇 ROX 通道，檢測人乳頭瘤病毒35、39、68-DNA 及β-球蛋白；選擇CY5通道，檢測人乳頭瘤病毒31、33、52、66-DNA，進行檢測。循環參數設置為：50℃ 2 min；94℃ 5 min；94℃ 15 s，57℃ 30 s，共45個循環。

1.4 統計學方法

利用SPSS 21.0軟件進行統計學處理分析。以例數或拷貝數代表計數資料，采用χ2檢驗，當P<0.05時，結果具有統計學差異。

2 結果

2.1 各類宮頸病變組織HPV16,18,52型分布及DNA水平

宮頸癌組患者HPV16,18陽性檢出率、DNA拷貝數與宮頸炎正常組比較有統計學差異(P<0.05)。宮頸炎組HPV52型陽性檢出率、DNA拷貝數與宮頸炎正常組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表1、2。

表1 各類宮頸病變組織HPV16,18,52型分布 例

表2 各類宮頸病變HPV16、18、52型DNA水平

2.2 HPV16、18、52在各類宮頸疾病的分布情況

檢測結果分析顯示；宮頸癌患者中HPV16亞型單一感染率最高，而宮頸炎患者中HPV52單一感染率居多。宮頸炎單一感染21例，多重感染8例；宮頸癌單一感染50例，多重感染23例。宮頸癌的單一感染率低于宮頸炎，見表3。同時反映出感染HPV16、18亞型很大程度可能會發生宮頸癌病變，且復合檢出率中多為HPV16與其他亞型的復合感染。見表3。

表3 HPV16、18、52在不同疾病的感染分布 [n(%)]

3 討論

國內外專家研究表明，宮頸疾病的發生和發展可能與各類人乳頭瘤病毒感染有關[1-3]。德國Haras WzurHausen病毒學博士于1974年發現了HPV，第一次提出高危型HPV病毒感染是宮頸疾病的主要誘因，證實HPV與宮頸癌存在著必然的聯系[5，6]。本研究對患者HPV16,18,52基因進行分析，研究結果表明宮頸癌患者HPV16型病毒陽性率為64%，HPV18型病毒陽性率為33.3%。宮頸炎患者中HPV16型病毒陽性率為6.7%，HPV18型病毒陽性率為4%，HPV52型病毒陽性率為28%，且DNA拷貝數隨疾病嚴重程度而呈現增加趨勢。據統計結果發現宮頸疾病類型與HPV不同亞型有很大程度相關性，陽性檢測結果中HPV16、18亞型在宮頸癌組表達高于宮頸炎，而宮頸炎組HPV16、52亞型的檢出率明顯，同時發現HPV16易于其他亞型產生復合感染，且HPV16、18亞型是引起宮頸癌病變的重要因素。因此可將檢測HPV亞型類別做為早期宮頸疾病篩查依據，警惕女性宮頸癌變。而從各組HPV檢測為陽性的患者年齡范圍可分析看出宮頸疾病感染患者愈加年輕化，探求有效檢測、提早預防的手段是非常有必要的。建議廣大各年齡段女性定期檢查各類HPV病毒，早期篩查，及時診斷，預防或避免宮頸疾病的發生和擴散，保障自身健康和生活質量。