MMP-2 及TIMP-2 在稽留流產絨毛組織中的表達及意義

焦雪娟通信作者，余文華

(蚌埠醫學院第一附屬醫院婦產科，安徽 蚌埠 233000)

0 引言

稽留流產，可稱之為過期流產，其含義為胎兒在死亡一段時間內不能被正常排出體外，仍然滯留在宮腔內。引發稽留流產的因素有很多，其發病率也極高，其中包括的因素有遺傳基因異常、生殖器官有異、生殖器官感染、內分泌失調以及外界環境因素，另外還有大約60%-70%的個體其患病原因尚不明確。子宮內膜細胞外基質的關鍵組成成份包括層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原，當胚胎植入以及受精卵著床的時候，則需要將其進行降解。關于調節子宮內膜細胞外基質上膠原的合成，則是由兩組酶及其抑制因子進行，分別是基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制因子,半胱氨酸組織蛋白酶和半胱氨酸組織蛋白酶抑制因子。

本研究擬搜集稽留流產婦女（16 例）和正常早孕婦女（21例）的絨毛組織，通過Western-blot 檢測MMP-2（基質金屬蛋白酶-2）和TIMP-2（基質金屬蛋白酶組織抑制物-2）在絨毛組織中的表達，研究稽留流產與MMP-2 及TIMP-2 的相關性，進一步查找稽留流產的具體的病因，這給以后對稽留流產進行治本療法提供了條件。

1 資料與方法

1.1 一般資料

時間跨度控制在2019 年11 月至2020 年11 月期間，選取在我院婦產科門診就診的稽留流產患者16 例，年齡24～44歲，停經時間42～85 天。選擇同期就診我院婦產科門診要求終止妊娠的21 例正常早孕婦女作為正常對照組，年齡17～43歲，停經時間42～63 天。兩組年齡、停經時間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

1.2 入組標準

實驗組個體標準：（1）個體確診為稽留流產；（2）經胚胎染色體測試，夫妻皆無異常；（3）經白帶及超聲檢查，個體無生殖器官異常和被感染現象；（4）男方精液無異；（5）個體體內抗體呈陰性，包括抗甲狀腺球蛋白、抗核酸抗原、抗心磷脂這些抗體；另有停經史以及陰道無血或陰道有少量血的臨床癥狀，宮內妊娠經彩超檢測，呈無胚芽現象或者無心管搏動現象。對照組個體標準：正常妊娠但在懷孕12 周內進行人工流產的個體，無自然流產病史，此次妊娠陰道臨床癥狀表現正常；胚胎經彩超檢測為正常，呈有胚芽現象以及有心管搏動現象。

1.3 Western blot 檢測MMP-2、TIMP-2 蛋白表達

無菌操作下收集人工流產時取出的絨毛，用PBS 漂洗去除血污后，通過冷PBS 進行流動性洗滌，將已經預冷過的細胞裂解液取出，對細胞進行裂解，最后把總蛋白提取出來，且實行蛋白定量，將總含量為25μL 的細胞總蛋白與上樣緩沖液進行變性，而后通過10%聚丙烯酰胺凝膠來進行電泳分離，最后將其轉移到硝酸纖維素膜中；把硝酸纖維素膜放在5%脫脂奶粉中，室內溫度下密閉2h；另外將兔抗人MMP-2、TIMP-2 一抗（1:300）置于4°C 中過夜；已經添加了辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1:1000）置于37°C 中2h，添入化學發光底物常規顯影，將β-actin 作為內參照。

1.4 統計學處理

實驗數據以均數±標準差表示，各組間比較采用t檢驗，P<0.05 確定為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組絨毛組織中MMP-2、TIMP-2 蛋白表達水平

與正常終止妊娠患者相比，患有稽留流產個體體內的MMP-2 蛋白表達水平以及TIMP-2 蛋白表達水平都顯著下調（***P<0.01,**P<0.1）。見圖（1-6）及表（1,2）。

2.2 實驗結果

圖1 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流產患者絨毛組織中的表達

圖2 MMP-2 和TIMP-2 在稽留流產患者絨毛組織中的表達

圖3 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達

圖4 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達

圖5 MMP-2 和TIMP-2 在正常終止妊娠絨毛組織中的表達

圖6 MMP-2 和TIMP-2 在不同患者絨毛組織中的表達量的差異

表1 MMP-2 t 檢驗

表2 TIMP-2 t 檢驗

3 討論

基質金屬蛋白酶（MMPs），其屬于鋅離子依賴性蛋白酶，一般情況下，都是呈非活性酶原狀態而滲出細胞外的，現如今起碼已經有18 種MMP 被發現了，它們共同組成了MMPs超家族，MMPs 超家族中最關鍵的MMP 之一是Ⅳ型膠原酶，其可由兩個亞型組成，分別是MMP-2（72KD 型，明膠酶A）以及MMP-9（92KD 型明膠酶B），Ⅳ型膠原和彈力纖維是MMP-2 和MMP-9 的關鍵作用底物，另外還含有消融明膠的特點。基質金屬蛋白酶抑制物(tiSSueinhibitorsofmet alloproteinases,TIMPs) 能夠阻礙MMPs 進行活化。按照各類TIMPs 出現的時間次序進行定名，分別稱之為TIMP-1，TIMP-2，還有TIMP-3 和TIMP-4，不管是活化的MMP-2 還是非活性的MMP-2，TIMP-2 都能夠跟它進行聯結，最終得到比例為1:1 的化學復合物，并且MMP-2 會因此沒了活性，也就沒了破壞膠原的能力[4,5]。在細胞外基質進行降解的時候，MMPs 與TIMP 之間所維持的動態平衡在其中有極大的影響。

不管是胚胎植入還是受精卵著床的時候，子宮內膜細胞外基質都需要被降解，此過程類似于惡性腫瘤的生物學行為，層粘連蛋白、纖連蛋白以及膠原共同組成了子宮內膜細胞外基質的關鍵部分。在滋養細胞達成掠奪的途中，子宮內膜細胞外基質(ExtraeellularMatrix，ECM)的降解在其中有著十分關鍵的調節作用。Niu[6]等研究結果顯示：有活性的MMP-2在妊娠早期由絨毛組織泌出，隨著胎盤的生長發育，在妊娠整個時期都會有TIMP-1,2 的存在。Xu[7]等報道表示：人滋養細胞會分泌出MMP-2,9 以及對MMP-2,9 進行調節，另外還會分泌以及調節組織抑制物TIMP-2,1，孕期達到6 周后滋養細胞就能夠泌出MMP-2，孕期達7 周后MMP-9 水平會持續升高。蔣德菊等[8]研究顯示，患有稽留流產個體體內的TIMP-1表達率增加，因此預測在稽留流產發病期間，MMP-9/TIMP-1的動態失衡對其有著極大的影響。

炎癥對妊娠有極大的影響，胎膜提早被破以及早產風險提高的原因，跟細胞因子與基質金屬蛋白酶(MMPs)之間出現動態失衡的情況息息相關[9]。MMP 能夠由好幾種細胞類型所形成。于正常個體組織里，運用免疫組織化學技術幾乎檢驗不到MMP 的存在，不過當個體被損傷及個體懷孕時，其體內的蛋白質沉積會加多。MMP 能夠將細胞外基質（ECM）中的好幾類蛋白質進行降解，且經過分解基質中關鍵的支架大分子而踴躍參加重塑ECM 活動。MMP 與TIMP 共同維持動態平衡，以保證孕早期正常及胎盤發育順利。明膠酶MMP-2和MMP-9 是尤其涉及成功細胞滋養細胞浸潤在妊娠早期，因為它們是在基底膜，其主要由IV 型膠原蛋白的降解被認為關鍵酶[10]。MMP 的組織抑制劑（例如TIMP-1 和TIMP-2）調節蛋白酶的活性。胎兒滋養層細胞侵襲子宮內膜后，會對人胎盤實行介導作用。某種特定的蛋白水解酶的分泌可以對子宮內膜基底膜以及子宮內膜細胞外基質進行降解，而且這種酶的分泌能夠精準調節滋養細胞的侵襲。在自然終止妊娠中，MMP-9 含量以及MMP-2/TIMP-2 復合物含量的增加對此也許存在影響[11-12]。

綜上所述，MMP-2 和TIMP-2 在子宮內膜中的研究比較廣泛，涉及了多種婦科疾病。經過研究得出，MMP-2 的表達水平以及TIMP-2 的表達水平在患有稽留流產個體的絨毛組織中處于明顯性降低狀態。另外MMP 和TIMP 都參與組織重塑，伴隨著組織的快速生長和結構變化。由于妊娠是一個動態的環境，并且MMP 在整個妊娠過程中都對其持續重塑做出了貢獻，因此有必要對該領域進行進一步的研究。

總而言之，可得出結論：也許在稽留流產的發生機制中，MMP-2/TIMP-2 的存在非常關鍵，不過對其在分子調控機制方面的詳情未能明確，因此，我們將在未來的研究中探討具體的分子調控通路。