一株仔豬腹瀉致病性大腸桿菌的分離鑒定

陳亮 劉雪松 黃思琪 張蕾 馮萬宇 李丹 蘭世捷 苗艷 沈思思 黃寶銀 史同瑞*

1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 161005

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 150030

大腸桿菌可以引起仔豬的腹瀉，根據(jù)豬的日齡以及和致病性大腸桿菌的血清型不同，可以將仔豬腹瀉疾病分為仔豬黃痢、仔豬白痢以及仔豬水腫病等。引起仔豬腹瀉大腸桿菌的致病因子較多，包括了黏附素和腸毒素等。在仔豬腹瀉大腸桿菌中常見的黏附素為K88、K99 以及987P 等。致病性大腸桿菌可以通過黏附素的黏附作用讓大腸桿菌定居在小腸上皮上，大量繁殖并分泌腸毒素，從而影響動物機(jī)體的水分吸收排泄平衡，造成腹瀉。

2020 年10 月黑龍江齊齊哈爾市周邊某豬場發(fā)生仔豬腹瀉癥狀，對該豬場病死仔豬進(jìn)行剖檢，將無菌得到的病料進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，測定其含有的毒力基因，并通過藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料

1.1 病料無菌采集腹瀉仔豬病料，包括肝臟、脾臟以及小腸等。

1.2 試劑伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司生產(chǎn)。MH 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。50×TAE，北京拓奧達(dá)科技有限公司生產(chǎn)。革蘭氏染色液，常德比克曼生物科技有限公司生產(chǎn)。藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)。DNA Marker，大連Takara 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 病原菌分離培養(yǎng)將病料無菌接種到鑒別培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

2.2 黏附素毒力基因檢測根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，合成相應(yīng)毒力基因，以細(xì)菌菌液為模板提取DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。毒力基因引物序列如表1 所示。

表1 黏附素毒力基因引物序列

2.3 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)采用CLSI 指導(dǎo)進(jìn)行。將細(xì)菌培養(yǎng)到1.5×108CFU/mL，均勻涂抹于MH 瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻安放在平板上，培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 腹瀉仔豬剖檢結(jié)果腹瀉仔豬剖檢結(jié)果如圖1 所示，可以看出腹瀉仔豬出現(xiàn)小腸積氣、腸出血以及卡他性腸炎癥狀。

圖1 腹瀉仔豬解剖圖

3.2 細(xì)菌分離鑒定及毒力基因檢測從病料中分離出來的細(xì)菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤的菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)粉紅色菌落。通過革蘭氏染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)分離得到的細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，多散在，兩端鈍圓。可以確定為分離的細(xì)菌為大腸桿菌。毒力基因檢測結(jié)果如圖2 所示。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該株細(xì)菌攜帶K99 毒力基因，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）。

圖2 毒力基因檢測結(jié)果

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該株細(xì)菌對左氧氟沙星、阿米卡星、頭孢曲松以及頭孢哌酮具有敏感性，對于四環(huán)素以及環(huán)丙沙星耐藥，對于慶大霉素處于中介狀態(tài)。

4 討論

引起仔豬腹瀉的多為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。其中豬源的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌經(jīng)常攜帶的黏附素為K88、K99 以及987P 等。

豬大腸桿菌性腹瀉病的預(yù)防最主要的手段之一便是疫苗免疫。多種因素會影響最后仔豬獲得的免疫效果。卵黃抗體有著效價(jià)高、獲取量大以及性價(jià)比高的特點(diǎn)。最重要的是卵黃抗體粉可以直接作為飼料添加劑為仔豬提供主動免疫力。路桂霞將K88、K99、987P 和F41 黏附素作為免疫抗原，制備出了抗仔豬大腸桿菌病卵黃抗體，并進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該種特異性卵黃抗體對仔豬大腸桿菌病具有良好的防治效果。劉文鑫對大腸桿菌K88、K99 天然菌毛及表達(dá)蛋白卵黃抗體進(jìn)行了制備及初步應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)制備的卵黃抗體可與相應(yīng)的大腸桿菌發(fā)生特異性凝集，并對仔豬黃、白痢具有良好的防治作用。