高毒力肺炎克雷伯菌中KPC-2型碳青霉烯酶對細菌毒力的影響

祝俊英， 魏 清， 沈 震， 袁 挺， 李 敏

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）被WHO列為“緊急威脅” 人類健康的病原菌，可引起嚴重的肺炎、血流感染及肝膿腫等[1]。目前對臨床威脅最大的主要是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）和高毒力/高黏液肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae， hvKP）[2-3]。CRKP主要引起醫院獲得性感染，毒力低但耐藥率高，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制是產碳青霉烯酶，臨床常見的碳青霉烯酶主要有 KPC-2、NDM-1及 OXA-48[4]。相較于 CRKP，hvKP多表現為高黏液表型，耐藥率低但毒性較強，主要引起社區獲得性肝膿腫，且極易引發眼內炎和腦膜炎等侵襲綜合征，致死率及致殘率較高[5]。隨著細菌耐藥及毒力的傳播擴散，毒力高且對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌不斷出現。2016年Zhang等[6]首次報道了浙江地區由K1型ST1797碳青霉烯類耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）引起的醫院感染，引發了極大的關注。

本研究通過體外過表達blaKPC-2并轉化hvKP的方法構建碳青霉烯類耐藥的hvKP株，即CR-hvKP，比較hvKP耐藥前后細菌毒力變化， 現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

收集上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院2018年1—12月臨床標本中分離的3株碳青霉烯類敏感的高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitive hypervirulentKlebsiella pneumoniae， CS-hvKP） 作為實驗菌株。體外藥物敏感性試驗采用肉湯微量稀釋法。參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）方法進行[7]。

1.2 高黏液表型（HM）檢測、莢膜血清分型及毒力基因檢測

1.2.1 拉絲試驗 采用黏液拉絲試驗檢測細菌高黏液表型，用接種環輕觸血瓊脂平皿上過夜培養的新鮮菌落向外牽拉，重復牽拉2次，若2次均有黏液絲形成并且長度大于5 mm即判為HM表型陽性[8]。

1.2.2 毒力基因PCR檢測 采用PCR方法擴增檢測10種毒力基因及6種常見莢膜血清分型，毒力基因包括（rmpA、rmpA2、iroB、iutA、ybtS、entB、allS、mrkD、magA、kfu），血清型包括K1、K2、K5、K54、K57 及K20。PCR擴增引物及條件參照文獻[9-10]。

1.3 細菌分子流行病學檢測

采用多位點序列分型（MLST）對hvKP進行同源性分析。PCR擴增細菌7個管家基因片段（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）后測序，結 果 與 網 站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）進行比對。

1.4 轉化株CR-hvKP（blaKPC-2）構建

1.4.1 pHSG396-KPC重組質粒的構建 自行設計blaKPC-2基因全長的擴增引物，5’處添加酶切位點和保護堿基，引物信息見表1。選取臨床上分離的經PCR擴增并測序分析后確定為blaKPC-2陽性的肺炎克雷伯菌，采用煮沸法制備模板，擴增blaKPC-2，將PCR產物酶切后連接至pHSG396載體上，并轉化至DH5a感受態細胞，在含50 mg/L氯霉素的LB平板上篩選陽性轉化子，將轉化子增菌培養后，抽提重組質粒，核酸定量后－20℃保存備用。

表1 pHSG396-KPC重組質粒構建的擴增引物Table 1 Amplification primer for construction of pHSG396-KPC recombinant plasmid

1.4.2 pHSG396-KPC重組質粒的轉化 將3株臨床分離的hvKP增菌培養至對數期，制備電轉化感受態細胞，將pHSG396-KPC重組質粒電轉至敲除株中，在含50 mg/L氯霉素的LB平板上篩選陽性轉化子，鑒定轉化成功的細菌為CR-hvKP，即blaKPC-2轉化株。

1.5 血清抵抗試驗體外檢測細菌毒力

采用血清抵抗試驗檢測細菌對血清中補體等殺菌物質的抵抗能力，方法參考文獻[11]。將待測菌株增菌培養至對數生長期并調整菌液濃度為1×106CFU/mL，將上述菌液分別與健康成年人的混合血清按照體積比1∶3混合在一起，37℃孵育，對孵育0 h、1 h、2 h和3 h后混合物進行活菌數計數（viable counts， VC）。計算存活率（survival rate， SV），即 1 h/0 h、2 h/0 h、3 h/0 h 相應表示為SV1h、SV2h及SV3h。按照參考文獻[12]根據細菌存活率變化劃分為6個等級（1級：SV1h＜10%，SV2h＜10%，SV3h＜0.1%；2級：SV1h10%～100%， SV3h＜10% ；3 級 ： SV1h＞100%，SV2h＜100%，SV3h＜100% ；4 級 ：SV1h＞100%，SV2h＞100%， SV3h＜100% ；5 級 ：SV1h＞100%，SV2h＞100%，SV3h＞100%在第三階段菌落數有所下降 ；6 級 ：SV1h＞100%， SV2h＞100%， SV3h＞100%在3個階段菌落數一直上升），1級和2級為對血清中殺菌物質敏感，3級和4級為中介，5級和6級為耐藥。

1.6 結晶紫染色法測定生物膜形成能力

生物膜測定參考文獻[13]，將待測菌液濃度調整為1×107CFU/mL，取150 μL待測菌株加入96孔平底板，同時做3個復孔，37℃孵育16～24 h后用0.5%的結晶紫染色20 min， 蒸餾水將未結合染料沖洗干凈，結合染料用95%乙醇溶解后檢測600 nm處吸光度（D）。實驗重復3次，取平均值。將生物膜形成能力按照D600測定值作以下分類：強生物膜形成能力（D600＞0.5），中等生物膜形成能力（0.2≤D600≤0.5），弱生物膜形成能力（D600＜0.2）。

1.7 細菌黏液性檢測及莢膜多糖測定

1.7.1 低速度離心法檢測細菌黏液性 細菌黏液性測定參照文獻[13]，將培養6 h的菌液濃度調整至D600為1.0，低速度（1 000×g）離心5 min，測定上清液D600。與低黏液性菌株相比，高黏液性菌株沉淀不堅實，且上清液較為渾濁，D600較高。

1.7.2 苯酚-硫酸法檢測細菌莢膜多糖含量 細菌莢膜多糖提取及測定參照文獻[14]。500 μL過夜菌與100 μL含有1% zwittergent 3-14的檸檬酸（pH 2.0）混合，50℃孵育過夜，離心取上清液250 μL，加入無水乙醇，4℃沉淀莢膜多糖，30 min后離心去掉上清液，沉淀在管底的莢膜多糖晾干后用100 μL蒸餾水溶解。提取好的莢膜多糖與一定濃度范圍（0、50、100、150、200 mg/L）的糖醛酸標準品均進行以下測定，加入600 μL硫酸（含12.5 mmol/L硼酸），煮沸5 min后，加入3-氨基苯酚至體積比為0.15%，測定D520，莢膜多糖含量經糖醛酸標準曲線計算得出。同時，對500 μL過夜菌進行稀釋計數，最終，莢膜多糖含量經換算單位表示為μg/109CFU。

1.8 熒光定量PCR（RT-PCR）檢測莢膜多糖結構基因及調控基因轉錄水平

提取hvKP野生株及blaKPC-2轉化株的mRNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。RT-PCR檢測hvKP野生株及blaKPC-2轉化株莢膜多糖結構基因orf1-2（galF）、orf3-15（wzi）、orf16-17（manC）及調控基因rmpA、rmpA2轉錄水平表達量。采用2-ΔΔCT法計算基因轉錄水平表達差異。hvKP野生株為對照菌株，23S rRNA 為內參基因，以rmpA基因為例，如下所示：

ΔCT= CT（rmpA基因）－CT（23S rRNA基因）

-ΔCt=ΔCT（hvKP野 生 株 ）－ΔCT（blaKPC-2轉化株）

2-ΔΔCT即為rmpA基因的表達量。

2 結果

2.1 hvKP野生株莢膜血清型、毒力基因分布及臨床資料

3株hvKP野生株均為HM陽性。其中1株（K1843）為ST23 K1型，來源于急診內科，標本類型為靜脈血，所檢測的10種毒力基因均為陽性。2株為ST65 K2型，來源于住院患者，標本類型分別為痰液（K1953）及肝穿刺液（K1722），2株hvKP 中rmpA、rmpA2、iroB、iutA、ybtS、entB、mrkD均為陽性，magA、allS及kfu均為陰性。見表2和表3。

表2 3株hvKP臨床資料及分子分型特征Table 2 Clinical data and molecular typing of the 3 hypervirulent Klebsiella pneumoniae strains

表3 3株hvKP藥敏結果及毒力基因攜帶情況Table 3 Antimicrobial susceptibility and prevalence of virulence genes among the 3 hvKP isolates

2.2 blaKPC-2轉化株的特性

瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，hvKP野生株中blaKPC-2為陰性，而過表達株中blaKPC-2為陽性，即為過表達及轉化成功，此外，藥敏試驗也顯示，hvKP野生株對亞胺培南和美羅培南敏感，而blaKPC-2轉化株對這兩種藥物轉為耐藥，該結果也可證實過表達及轉化成功。

圖1 hvKP野生株與blaKPC-2轉化株瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖Figure 1 Identification of wild-type hypervirulent Klebsiella pneumoniae and blaKPC-2 transformants by agarose gel electrophoresis

血清抵抗試驗顯示，K1843野生株在1 h、2 h及3 h生存率均超過100%，但在3 h時細菌存活率有所下降，按照判定規則可判定為5級，對血清中殺菌物質耐受。同樣地，K1953和K1722均可判定為3級，對血清中殺菌物質中介。而blaKPC-2轉化株均可判定為1級，對血清中殺菌物質敏感。見圖2。

圖2 hvKP野生株與blaKPC-2 轉化株血清抵抗試驗結果Figure 2 Serum assay of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

生物膜測定結果顯示，K1722野生株與blaKPC-2轉化株生物膜形成能力沒有差異。與K1953和K1843野生株相比，相應的blaKPC-2轉化株生物膜形成能力明顯下降，差異具有統計學意義，見圖3。

圖3 hvKP野生株與blaKPC-2 轉化株生物膜實驗Figure 3 Biofilm assay of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

2.3 細菌黏液性及莢膜多糖含量檢測

與3株hvKP野生株相比，blaKPC-2過表達株經低速度離心后，底部沉淀形成堅實，上清液較為清澈，黏液性明顯降低，且莢膜多糖含量明顯下降。見圖4A。

采用苯酚-硫酸法測定莢膜多糖含量并經標準曲線計算發現，3株hvKP野生株莢膜多糖含量明顯高于blaKPC-2過表達株，差異具有統計學意義（P＜0.001），見圖4B。

圖4 hvKP野生株與blaKPC-2轉化株莢膜多糖含量及黏液性測定Figure 4 Capsular polysaccharide production and mucoviscosity of hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

2.4 blaKPC-2轉化株莢膜多糖結構基因及黏液表型相關基因轉錄水平表達變化

hvKP野生株與blaKPC-2轉化株莢膜多糖結構基因及黏液相關基因轉錄水平差異經RT-PCR方法檢測，結果顯示，blaKPC-2轉化株3個結構基因（galF、wzi、manC）及黏液表型相關基因（rmpA、rmpA2）表達下調30%～70%，差異具有統計學意義，見圖5。

圖5 hvKP野生株與blaKPC-2轉化株莢膜多糖結構基因（A）及黏液相關基因（B）轉錄水平差異Figure 5 Transcriptional levels of capsular polysaccharide construction genes (A) and mucoviscosity related genes (B) in hvKP wild-type and blaKPC-2 transformants

3 討論

隨著抗生素使用及細菌間可移動元件的傳播擴散，新的超級細菌不斷出現。近年來，自浙江地區2019年首次報道了CR-hvKP后，該菌在臨床上檢出率越來越高，且已經出現了由CR-hvKP引起的醫院暴發感染的報道[15]。然而hvKP獲得碳青霉烯類耐藥基因如blaKPC-2后，對于細菌毒力的影響至今報道較少。近年來，眾多研究發現，細菌耐藥性的產生對細菌有多方面的影響。有學者認為細菌獲得耐藥性后會增強細菌毒力，也有學者認為會降低細菌毒力。Pozzi等[16]研究表明，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）可通過影響細菌生物膜表型、降低細菌蛋白酶產生而降低細菌致病力，此外，MRSA還可通過干擾細菌群體感應調節系統下調毒力細菌毒力基因表達。Choi等[17]通過體外改變hvKP脂質A結構構建黏菌素耐藥菌株，結果發現與野生株相比，黏菌素耐藥株黏液表型下降，莢膜多糖含量降低，毒力基因magA和rmpA2表達下降，細菌毒力降低。

本研究通過體外過表達blaKPC-2并轉化hvKP的方法構建blaKPC-2轉化株，比較同一遺傳背景下細菌獲得耐藥性后對毒力的潛在影響。結果發現hvKP獲得blaKPC-2后細菌對血清中殺菌物質的抵抗能力下降，生物被膜形成能力下降，細菌黏液性下降，莢膜多糖結構基因及調控基因轉錄水平下降，莢膜多糖產生量降低，即細菌毒力降低。然而Siu等[18]通過接合實驗將blaKPC-2和blaKPC-3接合至K1型hvKP，結果發現hvKP仍對血清中殺菌物質保持較高的抵抗能力及毒力。本研究與其他研究結果的差異可能與細菌獲得耐藥的途徑不同，本研究所采用的是過表達blaKPC-2，而Siu等[18]采用接合實驗的方法使hvKP野生株產生耐藥。此外，研究結果不同可能與實驗所選取的細菌本身的遺傳背景等有關。

無論細菌耐藥性的產生對細菌毒力是增強還是減弱，都是細菌適應環境后，向有利于細菌生存方向發展的表現。本研究結果顯示肺炎克雷伯菌獲得碳青霉烯類耐藥后會導致細菌毒力因子莢膜多糖量降低，但是臨床上已經出現了高毒力、高耐藥菌株導致患者死亡的案例[15]，這些超級細菌的出現會給臨床抗感染治療帶來極大的威脅，研究細菌毒力與耐藥性之間的關系對于臨床感染性疾病的診斷、治療及預防十分重要。