腦脊液宏基因二代測序技術在病毒性腦炎/腦膜炎中的應用

賈俊偉，巫嘉陵

(天津市環湖醫院神經康復科，天津 300000)

病毒性腦炎/腦膜炎是中樞神經系統感染最常見的疾病之一。流行病學調查顯示，病毒性腦炎的發病率為0.035‰～0.074‰，在各年齡段均可發病，致殘率和病死率較高，給家庭和社會造成沉重負擔[1]。病毒性腦炎/腦膜炎的早期診斷和治療對疾病的預后極其重要，可以避免嚴重的并發癥和后遺癥。目前病毒性腦炎/腦膜炎的診斷尚缺乏明確的金標準，主要依據病史、體格檢查、腦脊液檢查、病原學檢測、影像學檢查和腦電圖進行綜合判斷。其中病原學可以提供直接的病原學證據，是中樞神經系統感染性疾病精準診療的基礎。然而，腦組織或腦脊液的病毒分離及鑒定對標本要求極高且目標病毒譜窄、耗時長，無法滿足臨床需求[2]。另外，血清學檢查常因細菌污染出現假陽性結果，存在一定的局限性。20世紀80年代，基于聚合酶鏈反應的方法廣泛應用，其可早期快速地檢測樣本中的外源性基因，敏感性和特異性較高，但僅能檢測已知引物所能結合的病原體核酸片段，對未知病原體的檢測受限。

近年來興起的宏基因組二代測序技術，具有不針對特定的病原微生物、高通量、檢測速度快、覆蓋病原微生物范圍廣等優勢，開始應用于臨床感染性疾病的診斷[3-4]。其在中樞神經系統感染性疾病，尤其是病毒性腦炎/腦膜炎中的應用研究尚處于起步階段。本研究主要探討腦脊液宏基因二代測序技術在病毒性腦炎/腦膜炎中的應用。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年6月至2021年7月在天津市環湖醫院神經康復科住院診斷為病毒性腦炎/腦膜炎且經宏基因二代測序的11例患者的臨床資料。納入標準：①臨床診斷為病毒性腦炎/腦膜炎[5]；②均成功接受腦脊液檢查；③均送檢腦脊液宏基因二代測序。排除標準：①臨床資料不全；②同時合并其他神經系統疾病。

1.2研究方法 回顧分析患者的一般情況(性別、年齡)、既往史、起病形式、病程、癥狀與體征、腦脊液檢查(常規、生化、免疫、涂片、宏基因二代測序)、血清學檢查、頭磁共振成像檢查等。

1.3統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行描述性分析，計數資料用百分比表示，不符合正態分布的計量資料用中位數(四分位間距)[M(P25,P75)]表示。

2 結 果

2.1一般情況 11例患者中男6例、女5例，年齡58(36，65)歲。11例患者均急性起病，發病至入院時間為7(5，8) d，發病至入院后腰椎穿刺時間為8(5，9) d；既往史：體健2例、高血壓2例、糖尿病/血糖升高2例、冠心病3例、哮喘2例、青光眼1例、銀屑病1例、壞死性淋巴結炎1例、類風濕關節炎1例、腦梗死1例、胃炎1例、腦膜炎1例。臨床癥狀：發熱7例、頭痛9例、頭暈2例、惡心及嘔吐6例、精神行為異常4例、意識障礙3例、癲癇發作2例、肢體麻木1例、皰疹3例等。所有患者的臨床特征見表1。

表1 11例病毒性腦炎/腦膜炎患者的一般資料

2.2入院后血清學和腦脊液檢查結果 11例患者的血常規提示白細胞計數5.92(5.53，11.95)×109/L[正常值(3.5～9.5)×109/L]，血糖為5.81(5.30，8.40) mmol/L(正常值3.89～6.12 mmol/L)，氯為98(98，106) mmol/L(正常值96～108 mmol/L)。

11例患者腦脊液外觀均清亮透明，壓力為1.37(1.21，2.29) kPa(正常值0.78～1.76 kPa)，白細胞計數60(20,156)×106/L[正常值(0～8)×106/L]，蛋白0.7(0.6,1.3) g/L(正常值0.15～0.45 g/L)，葡萄糖3.2(2.6,4.3) mmol/L(正常值2.5～4.5 mmol/L)，氯125(118,126) mmol/L(正常值120～132 mmol/L)；涂片(抗酸染色、墨汁染色、革蘭染色及真菌菌絲及孢子)均為陰性。見表2。

2.3頭磁共振成像 11例患者中有4例表現為單側額葉、顳葉、島葉、頂葉或基底節區異常信號，其中，病例4在彌散加權成像、液體衰減反轉恢復序列或T2加權成像高信號(圖1)；3例患者表現為雙側額葉、顳葉、枕葉或頂葉皮質液體衰減反轉恢復序列高信號；4例患者行磁共振成像平掃及增強均無陽性發現。

表2 11例病毒性腦炎/腦膜炎患者的血清學及腦脊液檢查結果

a～d:彌散加權成像顯示右顳極極右顳內側、右側島葉、右側基底節高信號(白色箭頭)；e～h:液體衰減反轉恢復序列成像顯示右顳極極右顳內側、右側島葉、右側基底節高信號(白色箭頭)

2.4腦脊液宏基因二代測序結果 11例患者中，5例腦脊液宏基因二代測序陽性(表3)，其中病例1和病例3檢出人類皰疹病毒1型，病例2、病例4和病例10檢出人類皰疹病毒3型(水痘帶狀皰疹病毒)；其余6例患者腦脊液高通量二代測序均為陰性。

表3 5例病毒性腦炎/腦膜炎的腦脊液宏基因二代測序陽性結果

2.5自身免疫性腦炎抗體 6例宏基因二代測序陰性的患者完善自身免疫性腦炎抗體檢測，均為陰性。

2.6治療與預后 11例患者均采取更昔洛韋抗病毒及對癥支持治療，經治療7～16 d，患者發熱、頭痛、頭暈、嘔吐、意識改變及言語混亂等均較前好轉。出院后1個月隨訪，癥狀無反復。

3 討 論

病毒性腦炎/腦膜炎是中樞神經系統感染性疾病之一，能夠導致病毒性腦炎/腦膜炎的病毒較多，不僅包括皰疹病毒、腸道病毒、腺病毒、蟲媒病毒、彈狀病毒、副黏病毒等，還包括西尼羅病毒、靴雪野兔病毒、版納病毒及博爾納病毒等新發現的病毒[3,6]。其中皰疹病毒又包括單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、EB病毒和巨細胞病毒。該病的發生不僅取決于病毒本身的結構和致病特點，還決定于宿主自身的免疫狀態[1,7]。病毒性腦炎/腦膜炎主要累及腦實質和(或)腦膜；由于腦實質受累部位不同，病情輕重不一，臨床表現也不同。病毒性腦炎/腦膜炎的病程急性或亞急性，前期常表現為發熱、惡心及嘔吐等非特異性癥狀，后期表現為精神行為異常、意識障礙、癲癇發作、失語、飲水嗆咳、吞咽困難及肢體活動障礙等。

病毒性腦炎/腦膜炎的早期診斷主要根據患者的病史、體格檢查、腦脊液檢查、影像學、血清學及病原學檢測結果。其中腦脊液檢查是中樞神經系統感染常見的輔助檢查，在區分不同類型的中樞神經系統中發揮重要作用。病毒性腦炎/腦膜炎患者腦脊液的典型改變為壓力正常或升高；白細胞計數增多[(50～100)×106/L]，可高達1 000×106/L，以淋巴細胞增多為主；蛋白一般為正常或輕度升高，一般不超過0.5～1 g/L，葡萄糖及氯正常。而病原學檢測可以為中樞神經系統感染性疾病的診斷提供直接證據，其中包括分離培養法、涂片鏡檢法、酶聯免疫吸附測定、直接免疫熒光法、間接免疫熒光法、聚合酶鏈反應、依賴核酸序列的擴增技術、DNA微陣列技術、微球體懸浮芯片技術[3]。近年來，大規模基因組測序的需求推動了第二代測序技術的誕生，其通過對標本中的核酸序列進行測序，并與數據庫中微生物病原體的核酸進行對比，從而鑒定出可疑微生物。最初該項技術僅用于微生物實驗室的研究[8]，后來很多學者在臨床患者中應用該技術發現了新型致病微生物，因此宏基因二代測序技術由實驗室研究逐漸應用于臨床。

本研究回顧性分析腦脊液宏基因二代測序的11例住院患者發現，除3例患者皮膚有皰疹改變外，其他患者臨床表現均缺乏特異性，臨床癥狀表現為發熱、頭痛、頭暈、惡心及嘔吐、精神行為異常、意識障礙、癲癇發作、肢體麻木等。本研究中腦脊液宏基因二代測序為更早地識別病原微生物，及早地診斷和治療疾病提供了幫助。首先，腦脊液宏基因二代測序檢測時間短，本研究從腦脊液標本的送檢到檢測報告的提供時間為1～2 d，可以為臨床快速診斷提供病原學支持。其次，11例患者中，5例腦脊液宏基因二代測序有陽性發現，提示腦脊液宏基因二代測序技術可以為病毒性腦炎/腦膜炎提供病原學證據，從而減少病毒性腦炎/腦膜炎患者的誤診，避免患者早期接受經驗性免疫治療的風險。既往研究中，趙偉麗等[9]對中樞神經系統感染性疾病進行回顧性分析，發現宏基因二代測序在中樞神經系統感染疾病中的陽性率為47.12%(49/104)，高于傳統的病原微生物檢測；而在一項納入213例明確中樞神經系統感染患者的多中心前瞻性研究中發現，宏基因二代測序的陽性檢出率為57%[10]。Wilson等[11]研究發現，在58例中樞神經系統感染患者中，宏基因二代測序檢測發現32例，而傳統病原學檢測僅發現27例；另外，其中13例中樞神經系統感染僅依賴宏基因二代測序得以診斷。上述研究均證實了腦脊液二代測序技術對病原微生物的識別價值。高通量二代測序的檢測過程不需要特異性引物，可以檢測出未知病原體，對臨床上久治不愈或病情變化的感染性疾病的治療調整，尤其是一些新發感染性疾病的識別有重要意義。最初Palacios等[12]對器官移植后死于發熱性疾病的患者利用高通量測序技術發現了新的賓館提沙粒病毒。Xu等[13]對河南省發熱、血小板減少和白細胞減少綜合征的宏基因組分析發現了一種新的布尼亞病毒。Brown等[14]通過對25篇文獻中報道的44例疑似腦炎的病例進行總結與分析，證實了高通量二代測序技術在新發未明原因腦炎中的應用價值。

在本研究的5例陽性患者中，3例患者均檢出人類皰疹病毒3型，2例檢出人類皰疹病毒1型。金珂等[15]回顧性分析鄭州大學人民醫院住院的5例人類皰疹病毒性腦炎/腦膜炎患者的臨床資料，5例患者均進行腦脊液二代測序，其中1例檢出人類皰疹病毒1型、3例檢出人類皰疹病毒3型、1例檢出人類皰疹病毒4型。上述研究提示，人類皰疹病毒3型可能在導致病毒性腦炎/腦膜炎的病原體中居首位。

本研究中患者的特征均符合病毒性腦炎/腦膜炎的診斷，但根據2017年的中國自身免疫性腦炎診治專家共識[16]，在無明確病原體感染證據時兩者仍需要鑒別，這決定了下一步的治療方向，對疾病的病程或預后均有重要意義[17]。本研究中，5例患者的腦脊液宏基因二代測序均提示病毒感染，支持了病毒性腦炎/腦膜炎的診斷；患者自始至終均接受抗病毒治療，未接受激素、丙種球蛋白等免疫治療。而其他6例患者腦脊液宏基因二代測序提示陰性，需要警惕自身免疫性腦炎的可能，因此對這些患者完善了自身免疫性腦炎相關抗體的檢測，抗體結果為陰性，最終臨床診斷仍為病毒性腦炎/腦膜炎。研究發現，有27%的病毒性腦炎患者恢復期可能再次出現腦炎癥狀，稱為感染后自身免疫性腦炎[18-19]，通常出現在病毒性腦炎發病后3個月內，此時可能會出現自身免疫性抗體陽性，而無病毒感染證據。因此，本研究患者均需繼續隨訪，而宏基因二代測序可以為病毒性腦炎與自身免疫性腦炎的鑒別、感染后自身免疫性腦炎的識別提供病原學依據。

但高通量二代測序技術也存在一定的局限性[20]，如成本高昂、臨床測序檢測設備還未實現小型化、樣本質量控制及設備實驗條件的標準未規范、檢測結果的科學判讀證據尚待證實、假陽性及假陰性結果。本研究由于送檢實驗室不同，高通量二代測序的基本流程和管理要求、質量控制、性能驗證和標準化、報告解讀不同，可能影響本研究結果。另外，本研究中的6例患者雖經臨床確診為病毒性腦炎/腦膜炎，但高通量二代測序結果仍為陰性，可能原因包括以下幾點。①病毒載量低：患者接受腦脊液檢查前已經接受了經驗性治療，或者由于病毒性腦炎/腦膜炎的自限性，腦脊液樣本中的病毒載量低于高通量二代測序檢測的低限，造成假陰性結果；②遺傳物質的降解：本研究中腦脊液標本均在留取后及時冷鏈送檢，但仍不除外在標本留取、儲存及轉運期間出現DNA或RNA的降解，導致腦脊液樣本中的病毒序列數明顯下降，以致無法測出造成假陰性結果；③測序深度：測序深度作為宏基因二代測序質量的關鍵指標[3]，若深度不夠，可能導致一些病毒基因組信息無法被檢出。因此，目前該技術在病毒性腦炎/腦膜炎中的應用處于起步階段，仍有待完善和規范，需與傳統的病原學檢測方法相互補充，才能發揮其診斷價值。

總之，宏基因二代測序技術可以輔助病毒性腦炎/腦膜炎的早期診斷，為新發病毒性腦炎的識別、病毒性腦炎/腦膜炎與自身免疫性腦炎或感染后自身免疫性腦炎的鑒別提供病原學證據，為臨床診治策略的制訂提供幫助。但本研究為回顧性研究，病例選擇可能存在偏倚，且樣本量較少，有待進一步研究完善。