不同加工方式對大球蓋菇水提液揮發性風味成分和抗氧化能力的影響

盧 琪，薛淑靜，楊 德，王少華，李 露

（湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所, 湖北武漢 430064）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulataFarl.）又稱皺球蓋菇、酒紅球蓋菇，在世界范圍內廣泛種植[1]。大球蓋菇不僅產量高，其口感清爽宜人，具有較高的經濟價值，因此聯合國糧農組織推薦其在發展中國家種植，并公認為其是國際市場上的十大蘑菇之一[2?3]。大球蓋菇能夠在戶外種植，并以秸稈為培養基，分解秸稈，同時大球蓋菇收獲后的殘渣又能為大田提供養分，實現農業種植的綠色循環。我國于1992年引進大球蓋菇，目前已在全國范圍內大量推廣種植[4?5]，大球蓋菇產量大，成熟期相對集中，而新鮮的大球蓋菇貯藏期短，因此大球蓋菇加工技術的研發迫在眉睫。

除了干燥、腌漬和罐藏外，調味料的加工也是食用菌的加工方向之一[6]。大球蓋菇被證實富含各類營養和抗氧化成分，具有預防心臟病、高血糖、腹水癌等作用，同時其中含有豐富的氨基酸、核苷酸、有機酸、可溶性糖等，是理想的功能型調味料加工原料[2,7]。目前，食用菌調味料可通過噴霧干燥、溶劑提取、蒸餾等方式獲得，也可直接粉碎后復合到其它調味料中[8?9]。如何使大球蓋菇呈味成分分散溶解是加工的關鍵，揮發性風味成分也是食用菌呈味的關鍵。食用菌的熱處理，如漂燙、高壓蒸汽、微波處理等均對其風味有所影響，而非熱加工對其揮發性風味成分的影響尚未研究。超微粉碎技術在茶產業中的應用，可以改善茶液的顏色、風味和營養[10?11]，而其對大球蓋風味品質的影響尚未研究。本文基于熱加工（70 、90 ℃）和非熱加工（室溫、超聲、均質和超高壓），對比各工藝對不同粒徑大球蓋菇水提液風味品質的影響，以期為大球蓋菇在調味市場的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata） 于2019年12月采收于湖北武漢；正構烷烴（C6~C25） 色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；Folin-Ciocalteu試劑、抗壞血酸、2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1,3,5-三（2-吡啶基）-2.4.6-三嗪（TPTZ） 源葉生物科技有限公司；ABTS?+試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

PEN3電子鼻 德國Airsense公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用設備 美國Agilent公司；50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國 Supelco公司；手動固相微萃取進樣器 美國Supelco公司；Multiskan GO酶標儀 美國Thermo Fisher公司；XHF-DY高速均質機 寧波新芝生物科技有限公司；KQ5200DE超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；HPP-650超高壓設備 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；YR-6L超微粉碎機 濟南銀潤包裝機械有限公司；winner 3003激光粒度分析儀 濟南微納科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同粒徑菇粉的制備 新鮮的大球蓋菇，采收后清洗、切片后45 ℃熱泵干燥12 h。經粉碎機粗粉過80目篩后分別進行超微粉碎10 min和30 min[12]，進一步對過篩及超微粉碎后的菇粉進行粒徑檢測，對應的菇粉粒徑分別為（181.25±1.46）、（36.63±0.45）和（7.06±0.08）μm。分別用 P1、P2和 P3代表上述粒徑的菇粉。

1.2.2 大球蓋菇水提液的制備 將上述不同粒徑的菇粉分別采用熱加工和非熱加工的手段制備大球蓋菇水提液。1.0 g菇粉中加入30 mL蒸餾水（1:30 w/v），浸泡0.5 h，然后進行以下處理：a.熱處理，將上述混合物至于磁力攪拌器上以700 r/min的速度攪拌1 h，溫度設置為70 ℃和90 ℃。處理結束后樣品立即用冷水冷卻；b.超聲處理（UT），將上述混合物至于超聲清洗儀，于40 kHz下于室溫下提取1 h；c.均質（HG），將混合物置于均質機，采用18000 r/min的轉速，室溫 3 min，處理兩次；d.超高壓處理（HHP），上述混合物置于超高壓裝置內，室溫條件下，500 MPa保持10 min；e.室溫（RT），700 r/min 的速度下攪拌 1 h。

1.2.3 電子鼻分析 采用PEN 3便攜式電子鼻對大球蓋菇揮發性成分進行分析[13]。將10 mL大球蓋菇水提液置于頂空瓶中，30 ℃水浴及磁力攪拌條件下平衡30 min后插入Luer-lock針，電子鼻系統以300 mL/min的流速吸收頂空瓶中的揮發性氣體成分，送入傳感器。傳感器進行氣味分析，每秒采集一次進行測量，采集時間為180 s。

1.2.4 GC-MS分析 采用GC-MS對大球蓋菇揮發性成分進行分析[14?15]。10 mL大球蓋菇水提液置于螺口瓶中，加入NaCl 4 g，于40 ℃平衡10 min后，采用DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭，頂空吸附35 min。萃取結束后將萃取頭立即插入GC進樣口，250 ℃條件下解吸5 min[16]。GC參數為：程序升溫的起始溫度為40 ℃，保持1 min；以10 ℃/min 的速率升溫至70 ℃，保持2 min；再以3 ℃/min 的速率升溫至 105 ℃，保持 1 min；再以 10 ℃/min 的速率升溫至 180 ℃，保持 2 min；最后以10 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持3 min；MS參數設置為：EI離子源，電離溫度，230 ℃；電子能量，70 eV；四極桿溫度，150 ℃；質譜掃描范圍（m/z）35~400。揮發性成分通過質譜數據和比對（Wiley7.0和NIST05數據庫），列出匹配度大于80%的成分，并對比同一色譜條件下正鏈烷烴（C6~C25）標準品的出峰時間，參考前人的研究，對各揮發性成分進行定性分析，各揮發性成分用GC-MS峰面積來橫向對比[16]。

1.2.5 抗氧化能力分析

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 大球蓋菇水提液DPPH自由基清除能力參照之前的研究略有改動[17?18]：65 μmol/L 的 DPPH 乙醇溶液 280 μL 與 20 μL的大球蓋菇水提液混合，置于96孔板中，室溫放置30 min后于517 nm下測量吸光值。以Vc作為陽性對照進行相對定量（y=0.0012x+0.0438，R2=0.997）大球蓋菇水提液DPPH自由基清除能力的結果以每毫升大球蓋菇水提液中抗壞血酸當量表示（μmol AAE/ mL）。

1.2.5.2 FRAP鐵離子還原能力的測定 大球蓋菇水提液FRAP鐵離子還原能力參照之前的研究略有改動[17?18]：280 μL 的 Ferric-TPTZ 試劑中加入 20 μL 大球蓋菇水提液，置于96孔板中，室溫放置30 min于593 nm處測量吸光度。以Vc作為陽性對照進行相對定量（y=0.0029X+0.114，R2=0.998）。大球蓋菇水提液FRAP鐵離子還原能力表示為每毫升大球蓋菇水提液中抗壞血酸當量（μmol AAE/ mL）。

1.2.5.3 ABTS自由基清除能力測定 大球蓋菇水提液ABTS自由基清除能力參照試劑盒說明書進行操作：200 μL 的 ABTS?+溶液中加入 10 μL 大球蓋菇水提液，置于96孔板中，室溫放置6 min于734 nm處測量吸光度。以Trolox作為陽性對照進行相對定量（y=0.3025X+0.076，R2=0.996）。大球蓋菇水提液ABTS自由基清除能力表示為每毫升大球蓋菇水提液中Trolox當量表示（μmol TE/ mL）。

1.3 數據處理

以上實驗數據均重復三次取平均值。采用Duncan分析進行樣本差異性分析（IBM SPSS Statistics 20.0），P<0.05為顯著性差異。XLSTAT 2014進行主成分和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 電子鼻分析

采用電子鼻能夠高效、快速的區分揮發性成分的氣味信號[19]。圖1顯示了同一粒徑條件下各加工方式對大球蓋菇水提液揮發性成分的影響。很顯然P1與P2條件下，各處理中大球蓋菇水提液主要揮發性風味成分的電子鼻響應程度均表現為：超聲>超高壓>室溫>均質>70 ℃>90 ℃。雖然熱處理能促進食用菌呈味核苷酸的溶出，增加其鮮度[20]，但同時極大程度削減了其揮發性成分。非熱處理超聲和超高壓能夠豐富大球蓋菇揮發性成分。室溫條件下，甲基類成分（W1S）的電子鼻響應略高于其它處理，可能是由于此類物質比較不穩定，任何加工方式均能降低其電子鼻響應。P3條件下，除了兩種熱處理外，其它處理對大球蓋菇揮發性成分電子鼻響應的差距不大，說明超微粉碎到一定程度已經削弱了大球蓋菇揮發性成分。

圖1 不同粒徑條件下各處理條件下大球蓋菇提取液的電子鼻雷達圖Fig.1 Radar image of electronic nose obtained from S.rugosoannulata extracts processed by different methods

對比同一處理條件下（室溫、70 ℃、90 ℃、超聲、均質及超高壓）三種粒徑大球蓋菇水提液的電子鼻響應值，除90 ℃加熱處理外，其它各組處理中大球蓋菇水提液揮發性風味成分的電子鼻響應程度均表現為P1>P2>P3，說明粒徑的減小直接破壞大球蓋菇揮發性風味成分。超微粉碎能夠增加物料的表面積，對于農產品的營養成分和植物化學物質含量有直接的影響，可用于開發相關衍生食品[20?21]。然而，超微粉碎過程中的劇烈碾壓破碎可能直接破壞了大球蓋菇揮發性成分。非熱加工的超聲和超高壓處理，使得大球蓋菇水提液中硫化物和萜烯類成分（W1W）、芳香成分及有機硫化物（W2W）和氮氧化物（W5S）格外豐富。其它處理中除上述成分外，甲基類成分（W1S）亦占有一定比重。90 ℃加熱處理下，三種粒徑大球蓋菇揮發性相近，且均小于其它處理，可能由于高溫處理對揮發性成分具有進一步的破壞作用。

2.2 GC-MS分析

如表1所示，18種大球蓋菇水提液中共鑒定出47種揮發性成分，主要包含醇類、醛類、酮類、酯類、烷烴類及少量的雜環類。在六種處理方式中超微粉（P3）的揮發性成分含量最低，說明超微粉碎過程破壞了大球蓋菇揮發性成分。菇粉P1的揮發性成分含量最高，對應各處理對揮發性成分的排序為：超聲>超高壓>室溫>均質>70 ℃>90 ℃，與電子鼻實驗結果一致。超聲處理條件下，大球蓋菇水提液揮發性成分不僅含量高，揮發性成分個數最為豐富。己醇、1-辛烯-3-醇和己醛是大球蓋菇水提液中的重要成分，三者之和占總揮發性成分的75.02%~95.70%。

表1 不同加工條件下大球蓋菇提取液揮發性成分分析Table 1 Comparison of volatile compositions of S.rugosoannulata extracts processed by different methods

續表1

大球蓋菇水提液揮發性成分的PCA分析如圖2所示。本文以加工方式及揮發性成分為原始變量進行PCA分析，取其中2個主要成分F1=30.76%，F2=22.15%。由圖2a 可知，主要成分己醛和1-辛烯-3-醇在第一象限，與主成分1和主成分2呈正相關，由圖2b可知，與此類成分相關的處理為UT-P1、UT-P2和HHP-P1。2-十一酮、苯甲醛、十四烷、十六烷、鄰苯二甲酸二乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、2-甲基十一烷、2,6-二甲基十一烷、4,8-二甲基十一烷、3,4-二甲基戊烯、戊基丁內酯和3,6-二甲基癸烷在PCA圖中的第二象限，與主成分1負相關，與主成分2正相關，與此類成分對應的加工手段為70 ℃-P1、70 ℃-P2、70 ℃-P3 和 HHP-P3。2-環己烯-1-酮、N-己基甲胺、環丁醇、庚醇、2-正戊基呋喃和二十五烷在PCA圖中的第三象限，與主成分1和主成分2呈負相關，與此類成分對應的加工手段為90 ℃-P1、90 ℃-P2、90 ℃-P3、HG-P3、HG-P2、HHP-P2、UT-P3和 RTP3。十二烷、4-甲基十二烷、壬醇、戊醛、己酸乙酯、戊醛、丙位癸內酯、甲基壬基甲酮、2-甲氧基呋喃、辛醇、丙位壬內酯和己醇與主成分1正相關，與主成分2負相關，與此類成分對應的加工手段為HG-P1、RT-P1和RT-P2。圖3基于揮發性成分對大球蓋菇加工方式進行聚類分析，除UT-P3外，其它加工手段下的3種粒徑聚為一類，說明加工手段決定著大球蓋菇揮發性成分組成。上述加工方式可分為四類即超聲處理P1、P2中揮發性成分豐富，含量高，聚為一類。熱處理減少了其中揮發性的成分，且處理溫度越高，揮發性成分喪失嚴重，所以70 ℃和90 ℃處理的大球蓋菇各聚為一類。其它的非熱處理（室溫、均質和超高壓）得到的大球蓋菇揮發性成分數量和含量居中，合并聚為一類。

圖2 大球蓋菇水提液揮發性成分主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis (PCA) of volatile compounds in S.rugosoannulata water extracts

圖3 基于揮發性成分的不同大球蓋菇水提液加工方式聚類分析圖Fig.3 Representation of volatile compounds of S.rugosoannulata extracts resulting from agglomerative hierarchical clustering (AHC)

2.3 抗氧化能力分析

通過DPPH、ABTS和FRAP法綜合評價18種加工方法中大球蓋菇水提液的抗氧化能力(表2)，并進一步通過雙因素方差分析對比加工方式和菇粉粒徑對大球蓋菇水提液抗氧化性能影響(表3、表4、表5)。抗氧化機理可分為單電子轉移機制（SET）和氫原子轉移機制（HAT）[22?23]。DPPH 抗氧化原理是基于自由基清除作用，反應時間短，操作簡單[24]。本研究中熱處理顯著降低了大球蓋菇水提液的DPPH自由基清除能力，非熱加工的各處理中，大球蓋菇水提液的抗氧化能力均隨著大球蓋菇粒徑的減少而減弱。RT-P1的大球蓋菇水提液DPPH清除能力最強。由表3可知，加工方法和粒徑均對大球蓋菇水提液的DPPH值有顯著影響（P<0.001），且兩者交互作用顯著（P=0.001）。

表2 不同處理條件下大球蓋菇提取液抗氧化能力對比Table 2 The comparison of antioxidant abilities of S.rugosoannulata extracts processed by different methods

表3 不同加工方法和粒徑處理條件下大球蓋菇水提液DPPH值方差分析結果Table 3 Variance analysis of DPPH value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

ABTS法的抗氧化原理為抗氧化劑存在時能夠將抑制ABTS自由基的形成，降低體系顏色，此法體現了體系的總抗氧化能力，同DPPH法，ABTS法同時兼具SET和HAT原理[25]。除70 ℃熱處理外，其它大球蓋菇水提液的ABTS離子清除能力隨著大球蓋菇粒徑的減少而降低。RT-P1的ABTS離子清除能力最強。由表4，加工方法和粒徑均對大球蓋菇水提液的ABTS值有顯著影響（P<0.001），但兩者交互作用不顯著（P=0.102）。

表4 不同加工方法和粒徑處理條件下大球蓋菇水提液ABTS值方差分析結果Table 4 Variance analysis of ABTS value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

FRAP屬于單電子轉移（SET）反應原理，體現抗氧化劑的還原性[26]。本研究各處理得到的大球蓋菇水提液的FRAP值均隨著菇粉粒徑的減少而增大，且熱處理所得大球蓋菇水提液的鐵離子還原能力要顯著高于非熱處理，90 ℃-P3得到的大球蓋菇水提液鐵離子還原能力最強。由表5可知，加工方法和粒徑均對大球蓋菇水提液的ABTS值有顯著影響（P<0.001），但兩者交互作用不顯著（P=0.151）。超微粉碎和熱加工均能降低大球蓋菇水提液的DPPH和ABTS自由基清除能力，而超微粉碎結合熱處理卻增加了大球蓋菇水提液的鐵離子還原能力，可能是由于高強度的處理釋放了大球蓋蛋白螯合金屬，增強了體系的還原性，與之相關的原理有待進一步研究。

表5 不同加工方法和粒徑處理條件下大球蓋菇水提液FRAP值方差分析結果Table 5 Variance analysis of FRAP value of S.rugosoannulata extracts under various processing methods with different particle sizes of S.rugosoannulata

3 結論

采用熱處理（70、90 ℃）和非熱處理（室溫、均質、超聲和超高壓）加工不同粒徑的大球蓋菇（P1、P2、P3），獲得對應的大球蓋菇水提液，對比各水提液的揮發性成分和抗氧化性能，得到以下結論：己醇、1-辛烯-3-醇和己醛是大球蓋菇水提液的重要成分，占總揮發性成分的75.02%~95.70%。超微粉碎對大球蓋菇揮發性成分有破壞作用，粉碎粒度越細揮發性成分喪失越嚴重。P1條件下大球蓋菇揮發性成分最強，與之對應的各處理條件排序為：超聲>超高壓>室溫>均質>70 ℃>90 ℃。UT-P1條件下，大球蓋菇水提液揮發性成分含量高、種類多。RT-P1條件下，大球蓋菇水提液表現出最優的自由基清除能力，而90 ℃-P3得到的大球蓋菇水提液鐵離子還原能力最強。加工方法和粒徑均對大球蓋菇水提液的抗氧化能力有顯著影響。本研究為大球蓋菇在調味市場的精深加工提供參考。