大豆腦磷脂對漢麻分離蛋白Pickering乳液的形成及其性質(zhì)的影響

朱秀清，王 源，朱 穎，孟 妍，李志敏，劉燕清

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院, 黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室, 黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室, 黑龍江哈爾濱 150028）

漢麻，又稱大麻、線麻、火麻，在我國擁有悠久的種植歷史[1]，在紡織、榨油、制藥中[2?4]被廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)漢麻籽是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)來源[5]，其中蛋白質(zhì)含量在20%~25%[6]。對漢麻蛋白的研究始于20世紀初，主要集中于其在食品工業(yè)中的應用，如漢麻乳、漢麻蛋白粉及烘焙食品等[7?9]。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，漢麻籽蛋白具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[10]及降血壓、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化等生物活性，可以應用在功能性食品的研究與生產(chǎn)中[11]。

以固體顆粒代替表面活性劑作為乳化劑穩(wěn)定的乳液稱為Pickering乳液，具有粒徑分布可控、低毒性、制備方法簡單等多種優(yōu)點[12]。Pickering乳液的開發(fā)關鍵在于選擇具有合適表面潤濕性的乳化劑，近些年的研究集中在將不同來源的蛋白質(zhì)作為乳化劑制備Pickering乳液[13]。Burgos等[14]以羽扇豆分離蛋白作為食品級Pickering乳液穩(wěn)定劑，適當?shù)募訜峥梢蕴岣哳w粒的界面性，儲存14 d后依然保持穩(wěn)定；Feng等[15]用酪蛋白酸鈉修飾玉米醇溶蛋白顆粒制備Pickering乳液，與未修飾的蛋白相比，其具有更好的表面覆蓋率與離心穩(wěn)定性；Jiao等[16]針對花生分離蛋白凝膠顆粒為穩(wěn)定劑制備Pickering乳液進行研究，結(jié)果表明在不同pH條件下顆粒的聚集狀態(tài)不同，當乳液的連續(xù)相改變后，可獲得具有不同穩(wěn)定機制的乳液；Liu等[17]發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白濃度越大，Pickering乳液的乳化穩(wěn)定性越好，在一定的蛋白濃度下，油相占比越大，乳液的穩(wěn)定性越好；Sui等[18]以大豆分離蛋白與卵磷脂為原料制備Pickering乳液，結(jié)果表明不同頻率超聲處理后乳液的乳化性會有不同程度的提高，較高頻率的超聲處理可降低乳液的穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)因具有良好的兩親性、乳化性、凝膠性，且植物蛋白具有來源廣、成本低等優(yōu)點，在食品工業(yè)和制藥工業(yè)中常被用作穩(wěn)定O/W型乳液的乳化劑[19]。與其它植物蛋白相比，漢麻蛋白的乳化性稍差[20]，可通過適當?shù)男揎椧蕴岣咂涔δ芴匦浴ap?evi?-Hadna?ev等[21]通過不同的分離技術(shù)制備漢麻分離蛋白 (hemp protein isolate, HPI)，并對其乳化性進行評價，發(fā)現(xiàn)在HPI穩(wěn)定的乳液中，分離技術(shù)有利于pH誘導的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開、疏水位點和巰基的暴露，以及在乳化過程中由蛋白質(zhì)連接的液滴聚集體的形成；王慶玲[22]研究了不同改性方法對漢麻蛋白功能特性的影響，并發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)可使油滴更好地被漢麻蛋白包裹，形成液滴顆粒粒徑小且分布均勻的乳液、熱輔助pH偏移使蛋白質(zhì)在油-水界面的表面活性顯著增強，有利于蛋白質(zhì)乳化活性的提高；Chuang等[23]以麻仁球蛋白-酪蛋白酸鈉納米顆粒為原料制備Pickering乳液，發(fā)現(xiàn)納米顆粒中麻仁球蛋白占比越大，類固體性質(zhì)增加的程度越明顯，乳液的流動性越差。

磷脂作為一種重要的兩性表面活性劑，具有良好的乳化作用及界面吸附作用，在食品加工過程中以乳化劑的形式存在，也可以與其它穩(wěn)定劑結(jié)合起到乳化作用。研究表明[24]磷脂與食品中植物蛋白質(zhì)結(jié)合后可以改善食品的可食用品質(zhì)、增強其營養(yǎng)價值，在食品工業(yè)中具有很好的應用價值。磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)，簡稱腦磷脂，其在蛋黃磷脂中含量僅次于卵磷脂，與卵磷脂相比，腦磷脂含有更多的多不飽和脂肪酸，具有改善智力、促進大腦發(fā)育的功效，可以用來修飾蛋白質(zhì)以提高蛋白質(zhì)的功能特性及食用品質(zhì)。目前對大豆腦磷脂(soybean phosphatidyl ethanolamine, SPE)協(xié)同穩(wěn)定漢麻分離蛋白Pickering乳液還鮮有報道，本文通過改變SPE的添加量，探究SPE協(xié)同穩(wěn)定HPI乳液對乳液的乳化性、微觀形貌、粒徑、Zeta電位、流變特性、貯藏穩(wěn)定性的影響，研究HPI作為一種新型的乳化劑在Pickering乳液中的應用，為HPI穩(wěn)定Pickering乳液的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻籽 廣西巴馬；大豆腦磷脂 美國Sigma公司；大豆油 九三糧油工業(yè)集團有限公司；所有分析用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BS224S型分析天平 賽多利斯科學有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司；PCE-E3000型恒溫振蕩器 蘇州凱特爾儀器設備有限公司；Marvin 3000型馬爾文激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TG16-WS型離心機 湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XHF-DY型高速分散機 上海圣科儀器設備有限公司；pH-20型pH計 杭州杰源儀器科技有限公司；722E型分光光度計 上海圣科儀器設備有限公司；Anton-Paar MCR 302 動態(tài)流變儀 奧地利安東帕有限公司；XSP-BM-30AD顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漢麻分離蛋白的制備 漢麻分離蛋白（HPI）的制備參考Yin等[25]的方法并稍作修改。將漢麻籽與正己烷按1:8（g/mL）的比例混合進行脫脂，在室溫下振蕩8 h后，烘干、粉碎備用。將脫脂的漢麻籽與去離子水以1:20（g/mL）的比例進行混合制備漢麻分離蛋白，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)料液pH為8.5，在室溫下振蕩浸提 1 h 后，以 4000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 20 min，過濾后保留上清液，用 1 mol/L 的HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH為4.7后，在室溫下靜置0.5 h，以 4000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 20 min，過濾后收集沉淀，溶于水后調(diào)節(jié)pH至7.0，將其冷凍干燥后得到 HPI（蛋白質(zhì)含量92.47%），于?4 ℃ 下保存。

1.2.2 Pickering 乳液的制備 根據(jù) Sui等[18]的方法稍作修改進行乳液的制備，將漢麻分離蛋白溶于0.01 mol/L磷酸鹽溶液（pH為 7.0），配制質(zhì)量濃度為2%的漢麻分離蛋白溶液，加熱至45 ℃，磁力攪拌2 h后，以漢麻分離蛋白溶液與大豆腦磷脂的比例為4:1制備乳液,并置于高速分散器下，以12000 r/min的轉(zhuǎn)速處理2 min后制得Pickering乳液。

為研究SPE的添加量對乳液微觀結(jié)構(gòu)與性能的影響，以未添加SPE的乳液作為空白對照組，在蛋白溶液中加入HPI添加量10%、20%、30%、40%的SPE，按上述步驟進行乳液的制備，并對添加SPE的乳液和空白對照組的各項指標進行測定與分析。

1.2.3 乳液乳化活性的測定 乳液乳化活性測定參考Pearce等[26]與李良等[27]的方法并稍作修改。利用1.2.2的方法制備乳液，制得HPI-SPE乳液后取乳化層50 μL，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液稀釋至5 mL。充分混勻后，取其底部乳液進行測定，以0.1%的 SDS 溶液為空白對照，利用紫外可見分光光度計測其在500 nm波長處的吸光值，平行測定三次，取其平均值。乳液的乳化活性用乳化活性指數(shù)（EAI）表示，其計算公式如下所示：

式中：T=2.303；A0為乳液在波長為 500 nm 處的吸光值；C為蛋白質(zhì)單位體積質(zhì)量（g/mL）；φ為油相占比；N為稀釋倍數(shù)（n=100）。

1.2.4 乳液微觀觀察 將適量乳液滴在干凈載玻片上，確保沒有氣泡產(chǎn)生后，用蓋玻片蓋緊，放置于透反偏光顯微鏡下對其形態(tài)特征進行觀察并拍照。

1.2.5 乳液粒徑及 Zeta電位測定 乳液粒徑及Zeta電位測定參照Xu等[28]的方法并稍作修改。采用馬爾文激光粒度儀對HPI-SPE乳液的粒徑及Zeta電位進行測定。以磷酸緩沖液（pH7.0）為溶劑，顆粒折射率為1.470，吸收率為0.001，分散劑折射率為 1.330，以體積平均直徑（D4,3）表征粒徑。 HPISPE 乳液用 50 mmol/L 的磷酸緩沖液（pH 為 7.0）稀釋至澄清透明后進行測定，上樣體積為1 mL，測定溫度為室溫。重復測量3次，取其平均值作為測定值。

1.2.6 乳液表觀黏度的測定 使用流變儀測量HPISPE乳液的流變行為，測定其表觀黏度。設置PP-50模具平板間的間隙為1 mm，剪切速率設置為0.1~300 s?1，在 25 ℃ 下平衡 5 min，對 Pickering 乳液的表觀黏度進行測定[29]。

1.2.7 乳液的貯藏穩(wěn)定性測定 取不同SPE添加量的Pickering乳液適量裝入離心管中，觀察剛均質(zhì)后的乳液的乳析層并進行拍照。后將所有乳液置于4 ℃ 冰箱冷藏 7 d，7 d 后通過取出觀察乳液乳析層的變化并進行拍照，以此對乳液的穩(wěn)定性進行評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)重復測定三次，實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤差”的形式表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行ANONA 單因素方差分析，并采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液乳化活性的影響

由圖1知，乳液的乳化活性指數(shù)隨SPE添加量的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在添加量為30%時達到最大值為4.63 m2/g，隨著SPE添加量的繼續(xù)升高，乳化活性指數(shù)出現(xiàn)降低的情況。表明添加SPE后乳液的乳化性較未添加SPE時有明顯的提升，這是由于界面蛋白質(zhì)含量的提高以及高黏彈性膜的形成[30]，使乳化體系表現(xiàn)出良好的乳化性能；當SPE添加量為40%時，乳化活性有所降低。李秋慧等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，在大豆分離蛋白-磷脂乳化體系中，加入一定量的大豆卵磷脂可適當提高乳液的乳化活性，當大豆卵磷脂添加量達到15%后，乳化活性有所下降。這是由于添加SPE后，磷脂的疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團可以很好地覆蓋在油滴表面將其包裹，磷脂的親水基團與蛋白質(zhì)的親水基團可以更好地延伸入水中，形成雙親結(jié)構(gòu)，使乳液的穩(wěn)定性提高；當SPE添加量達到一定程度后，HPI與SPE的結(jié)合達到飽和，SPE會形成部分與乳液大小不同的液滴，使乳液液滴分布不均勻、粒徑不同，出現(xiàn)聚集、遷移等現(xiàn)象，從而導致乳化活性降低。

圖 1 SPE 添加量對 HPI乳液乳化活性的影響Fig.1 Effect of different SPE content on emulsion activity of HPI emulsion

2.2 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

從圖2中可以看出，未添加SPE的蛋白溶液雖未出現(xiàn)液滴聚集現(xiàn)象，但液滴顆粒分布不均勻。在添加SPE后，HPI可以更好地覆蓋油滴表面，分布均勻，形成更穩(wěn)定的乳液體系。隨著SPE添加量的增加，顆粒尺寸先增大后減小，當SPE添加量為30%時，顆粒分布的均勻程度最好；在SPE添加量為40%時，顆粒分布的均勻程度有所降低，出現(xiàn)更大尺寸的顆粒，這可能是由于SPE添加過量時會形成部分與乳液大小不同的液滴，使乳液液滴分布不均勻、粒徑不同。因此，適量添加SPE有助于乳滴更加均勻分布，提高乳液的乳化性，形成更加穩(wěn)定的乳液體系。

2.3 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液粒徑的影響

乳液的粒徑大小可以用來評價乳液的穩(wěn)定性，乳液液滴的粒徑越小，其乳析速度越慢，乳液就越穩(wěn)定[32]，因此可以通過觀察乳液液滴粒徑大小來判斷制得的HPI-SPE乳液的穩(wěn)定性。如圖3所示，隨著SPE添加量的提高，乳滴粒徑呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在SPE添加量為30%時達到最小值為125 nm，此時形成的乳液分布更為均勻，穩(wěn)定性更好；當SPE添加量為40%時，乳滴粒徑增加，形成的乳液穩(wěn)定性降低。這說明，適當添加SPE可以使更多的SPE與HPI結(jié)合，形成粒徑更小的乳滴，增加乳液的穩(wěn)定性。

圖 2 SPE 添加量對 HPI乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of different SPE content on microstructure of HPI emulsion

圖 3 SPE 添加量對 HPI乳液粒徑的影響Fig.3 Effect of different SPE content on particle size of HPI emulsion

乳液的分散指數(shù)（PDI）可以用來判斷乳液的粒徑分布，PDI值越小，其顆粒分布越均勻，所形成的乳液體系越穩(wěn)定。當SPE添加量為30%時，PDI值達到最小為0.23，此時乳液分散程度最好，與上文乳液微觀觀察的實驗結(jié)果一致；當SPE添加量為40%時，乳滴粒徑的增加導致其不能很好地分散于乳液體系中，從而導致PDI值增加。韓天翔等[33]對磷脂-大豆乳清蛋白乳化體系的研究指出乳滴的粒徑越小, 乳液越不容易發(fā)生絮凝、聚集等現(xiàn)象, 乳液的穩(wěn)定性越好。因此，添加SPE有助于乳液液滴的均勻分布，減少油滴聚集，形成更穩(wěn)定的乳液體系。

2.4 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液Zeta電位的影響

Zeta電位通常可以通過表征顆粒間相互吸引的能力來判斷溶液體系的穩(wěn)定性[34]，其穩(wěn)定性由Zeta電位的絕對值表示，絕對值越高，粒子間的排斥力越大，越不容易發(fā)生聚集，溶液體系越穩(wěn)定。由圖4所示，隨SPE添加量的增加，Zeta電位的絕對值呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當SPE添加量30%時Zeta電位值為?27.12 mV，形成的乳液電位絕對值最大。HPI表面帶負電，SPE顆粒帶負電，SPE與HPI相互作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)部的負電荷釋放出來，乳液的負電位絕對值增加，隨乳液中SPE添加量的增加，蛋白質(zhì)顆粒間靜電斥力增大，越不易發(fā)生聚集，乳液的穩(wěn)定性也逐漸增強；當SPE添加量30%時，乳液表面攜帶的負電荷量最多，Zeta電位值最大，受粒子間的排斥作用影響，此時乳液最穩(wěn)定。當SPE添加量為40%時，Zeta電位的絕對值減小，但仍高于未添加SPE的乳液，這可能是由于SPE加入量到達飽和后無法通過增加與蛋白質(zhì)間的靜電斥力來穩(wěn)定乳液，從而導致Zeta電位減小。研究表明磷脂-大豆乳清蛋白乳液乳滴的粒徑越小, Zeta電位值越大, 乳滴間的靜電排斥作用越強，乳液的穩(wěn)定性越好[33]，與本實驗趨勢一致。

圖 4 SPE 添加量對 HPI乳液 Zeta 電位的影響Fig.4 Effect of different SPE content on Zeta potential of HPI emulsion

2.5 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液表觀黏度的影響

流變學旨在研究物質(zhì)在外力作用下產(chǎn)生的變形和流動，根據(jù)流變曲線形狀，流體被分為牛頓流體和非牛頓流體兩類，非牛頓流體的黏度取決于溫度、剪切速率和剪切應力，因此又可將非牛頓流體分為膨脹型流體、塑性流體及假塑性流體三類[27,35]。如圖5所示，隨著剪切速率的增大，乳液黏度逐漸減小，表現(xiàn)出典型的非牛頓假塑性行為，即剪切稀化，是典型的弱締合相互作用。當剪切速率≤200 s?1時，SPE添加量為10%乳液的表觀粘度最低，這是由于凝集狀態(tài)的油滴在剪切過程中相互分離而產(chǎn)生的結(jié)果；當剪切速率≥200 s?1時，SPE 添加量為 30% 時，表面蛋白吸附量最大，液滴因攜帶負電相互排斥，表觀黏度最低，流動性最好。當SPE添加量為40%時，表觀黏度最大，有研究表明隨著表觀黏度的增加，油滴間接觸面積隨之增加，彼此間相互作用，形成了聚集的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[36]，這種情況可能是由于液滴顆粒相互碰撞、凝聚，使得乳液具有相當高的內(nèi)部阻力阻礙流動，所以表現(xiàn)出較高的黏度。

圖 5 SPE 添加量對 HPI乳液表觀黏度的影響Fig.5 Effect of different SPE content on apparent viscosity of HPI emulsion

2.6 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液貯藏穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，不同SPE添加量下漢麻分離蛋Pickering 乳液的外觀不同。圖6（a）為新鮮乳液的外觀，圖6（b）為在4 ℃條件下冷藏7 d后乳液的外觀，若乳液的乳析層出現(xiàn)破乳等現(xiàn)象，則說明乳液的穩(wěn)定性不好[37]。從圖6（a）可以觀察到新鮮制得的乳液是均勻的，未出現(xiàn)乳析或分層現(xiàn)象，說明未添加及添加SPE的乳液穩(wěn)定性良好；從圖6（b）中可以觀察到4 ℃冷藏 7 d后，未添加SPE的乳液水油分離，添加SPE的乳液未出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，這與葛慧娟等[38]研究得出的蛋白質(zhì)-多糖復合物穩(wěn)定的乳液未出現(xiàn)分層和析油現(xiàn)象，表明乳液具有良好的貯藏穩(wěn)定性的結(jié)論一致。

圖 6 SPE 添加量對 HPI乳液的貯藏穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different SPE content on storage stability of HPI emulsion

2.7 漢麻分離蛋白-大豆腦磷脂Pickering乳液穩(wěn)定機制解析

由SPE包裹的HPI（SPE-HPI）穩(wěn)定乳液的機理圖如圖7所示，在乳液體系中加入SPE后，SPE與HPI結(jié)合可以更加均勻地包裹油脂顆粒，使其粒徑更小，不容易聚集，乳液具有很好的穩(wěn)定性，且通過調(diào)節(jié)HPI與SPE 的比例可以獲得穩(wěn)定性不同的乳液。磷脂包裹的液滴主要是通過電荷的排斥作用來抑制液滴聚集，從而起到穩(wěn)定乳液的目的[39]。當pH大于4.65時，HPI表面帶負電荷[40]，在中性或堿性條件下，被磷脂包裹的液體通常具有較高的負電荷，二者通過產(chǎn)生強烈的靜電作用而避免顆粒的聚集，乳液的穩(wěn)定性增加。上述實驗結(jié)果表明，在HPI乳液中添加適量的SPE后，乳液的乳化活性增加，且流動性更好，Zeta電位絕對值增加，乳滴間的靜電斥力增加，可以避免乳滴聚集，使乳滴均勻分布于乳液中，乳滴粒徑減小、分布更均勻，可提高乳液穩(wěn)定性。當HPI乳液中加入SPE后，由于二者間靜電排斥作用，HPI結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的疏水基團暴露，腦磷脂尾部的疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團覆蓋在油滴表面，腦磷脂頭部的親水基團與蛋白質(zhì)的親水基團延伸入水中，形成雙親結(jié)構(gòu)，提高乳液穩(wěn)定性。因此可以說明，以SPE包裹的HPI顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的表面活性劑作為乳化劑可以很好地起到穩(wěn)定Pickering乳液的作用。

圖 7 SPE-HPI穩(wěn)定 Pickering 乳液機理圖Fig.7 Mechanism diagram of SPE-HPI stabilized Pickering emulsion

3 結(jié)論

采用HPI與SPE為穩(wěn)定劑制備 Pickering 乳液，通過調(diào)節(jié)SPE的添加量，得到穩(wěn)定性較好的O/W型Pickering 乳液。與未添加SPE的乳液相比，添加SPE的乳液乳化活性、乳滴粒徑、分散程度、Zeta電位、流變特性等指標均有所提升，在貯存7 d后仍保持穩(wěn)定。當SPE添加量為30%時，乳液的乳化活性最好，液滴顆粒較小且分布均勻，形成的乳液體系最穩(wěn)定。該實驗結(jié)果為大豆腦磷脂-漢麻分離蛋白穩(wěn)定的Pickering乳液的開發(fā)與其在食品工業(yè)中的應用提供了理論基礎。