金槍魚蒸煮液中蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及性質(zhì)分析

王欣欣，陳奕名，劉曉妍，位正鵬，王 鵬，劉瑞志，閆鳴艷，李銀平,

（1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院, 山東青島266042；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島266003；3.中國環(huán)境科學(xué)研究院, 北京100012；4.海洋功能食品國家地方聯(lián)合工程實驗室, 山東榮成 264309）

金槍魚是大洋暖水性洄游魚類，廣泛分布于世界中低緯度的近海、外海和大洋等地，是重要的經(jīng)濟魚種[1]，主要用于制作罐頭、魚干等產(chǎn)品。蒸煮是金槍魚加工過程中的主要步驟之一，每加工1 t原料，將產(chǎn)生0.5 t左右的蒸煮液[2?3]。蒸煮液成分復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、游離氨基酸、肽類、糖、脂類等物質(zhì)[4]。這些蒸煮液由于量大且難以儲存，往往得不到妥善地處理，一般直接排放，既造成資源的巨大浪費，又造成嚴重的環(huán)境污染。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過添加外源蛋白酶從低值的魚蒸煮液中制備多肽，可以得到營養(yǎng)價值高且必需氨基酸含量豐富的多肽，可用作保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的新型原料[5]。林云等[6]以鯖魚罐頭生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的蒸煮液為原料，采用復(fù)合酶分段酶解技術(shù)獲得不同相對分子質(zhì)量的生物活性肽，并研究了其抗氧化活性和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，向金槍魚加工蒸煮液中加入一定體積的無水乙醇后，可以沉淀出大量的蛋白，經(jīng)簡單表征后發(fā)現(xiàn)該蛋白的性質(zhì)和明膠極為相似。明膠是膠原水解后的產(chǎn)物，屬于一種大分子的親水膠體。魚明膠作為生物聚合物之一，被認為是哺乳動物明膠的優(yōu)良替代品[7]，且由于其獨特的功能特性，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域。如因其安全、經(jīng)濟、無副作用等特點，具有弱抗原性、生物可降解性及對血小板的凝聚作用，近年來也逐漸應(yīng)用于治療創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)的材料等[8]。

因此，從蒸煮液中提取蛋白對于水產(chǎn)加工企業(yè)廢棄液的環(huán)保化、高值化開發(fā)具有重要意義。但目前對于從金槍魚蒸煮液中提取蛋白并對蛋白進行表征方面的研究鮮見報道。鑒于此，本實驗對金槍魚蒸煮液中蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，并通過傅立葉紅外掃描、紫外掃描分析、圓二色譜分析、氨基酸分析等方法對其結(jié)構(gòu)進行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚蒸煮液 浙江省宏利達有限公司；無水乙醇、石油醚 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；鹽酸 分析純，煙臺遠東精細化工有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；苯酚、福林酚 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；濃硫酸 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

FDU-1200真空冷凍干燥機 東京理化器械株式會社；Nicolet傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；J-1500圓二色光譜儀 日本JASCO公司；UV-6100紫外分光光度計 上海美普達儀器有限公司； S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司；CT14RDⅡ高速臺式冷凍離心機 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸煮液成分測定 將魚蒸煮液解凍后過300目篩絹，測定其基本組成成分。灰分含量測定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；鹽度：JG 761-2016《電極式鹽度計檢定規(guī)程》，鹽度計測定；總脂肪含量測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；總糖含量測定[9]：苯酚-硫酸顯色法；蛋白質(zhì)含量測定[10?11]：凱氏定氮法、Folin-酚試劑法。

1.2.2 蒸煮液蛋白提取工藝 取適量金槍魚蒸煮液，按一定料液比加入無水乙醇，分別在不同溫度下攪拌反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后，4000 r/min離心15 min，取沉淀加入一定量的去離子水復(fù)溶，4000 r/min離心15 min，將上清液真空冷凍干燥后得蒸煮液蛋白，粉碎后對其進行結(jié)構(gòu)表征分析。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 pH對提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、提取時間3 h、固形物含量10%、室溫（25 ℃）的條件下，考察 pH2.0、4.0、6.0、8.0、10.0對蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.2 料液比對提取率的影響 在提取時間3 h、原始pH6.32、固形物含量10%、室溫（25 ℃）的條件下，考察料液比（v（樣品）:v（乙醇）=1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5、1:3.0、1:3.5 mL/mL）對蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.3 溫度對提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、提取時間3 h、原始pH6.32、固形物含量10%的條件下，考察提取溫度 25、30、35、40、45、50 ℃ 對蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.4 固形物含量對提取率的影響 對蒸煮液進行減壓濃縮或稀釋，獲得不同固形物含量樣品，在料液比1:2.5 mL/mL、提取時間3 h、原始pH6.32、溫度35 ℃的條件下，考察固形物含量10%、20%、30%、40%對蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.3.5 提取時間對提取率的影響 在料液比1:2.5 mL/mL、原始pH6.32、固形物含量10%、溫度35 ℃ 的條件下，考察提取時間 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h對蒸煮液蛋白提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取溫度、時間、料液比3個因素，以蛋白提取率為響應(yīng)值，進行Box-Behnken試驗設(shè)計[12?14]。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 蒸煮液蛋白結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 氨基酸組成分析 氨基酸組成分析：參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[15]，采用氨基酸自動分析儀對其進行分析。

1.2.5.2 紫外（Ultraviolet, UV）掃描分析 參考趙蒼碧等[16]的方法，將樣品置于紫外-可見光掃描儀上進行180~300 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.5.3 傅里葉紅外（Fourier Transform Infrared,FTIR）光譜分析 參考ZHU等[17]的方法，采用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在500~4000 cm?1區(qū)間掃描。

1.2.5.4 圓二色譜（Circular Dichroism, CD）分析參考WANG等[18]的方法，取適量樣品溶液置于光程為1 mm的樣品池中進行掃描分析。掃描波數(shù)為190~260 nm，溫度為 4 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Excel、Origin 9.0軟件和 Design Expert 8數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)取3次平均值，以折線圖形式表現(xiàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸煮液成分分析

測定金槍魚蒸煮液中蛋白質(zhì)、總糖、灰分、鹽度、油脂含量，結(jié)果如表2所示。從實驗數(shù)據(jù)分析可得，金槍魚蒸煮液中蛋白質(zhì)含量較高為25.51%，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提取的理想原料。粗脂肪含量為14.4%，據(jù)相關(guān)文獻報道[19]，金槍魚中脂肪多屬于不飽和脂肪酸，利于心血管疾病的預(yù)防，還含有少量總糖和灰分，分別占比3.57%、2.45%。

表2 金槍魚蒸煮液基本成分含量Table 2 Content of basic components in tuna cooking liquid

2.2 蒸煮液蛋白提取實驗

2.2.1 pH對蛋白提取的影響 由圖1可知，隨著pH的增大，蒸煮液蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在pH4.0和6.0時其提取率最高為53.22%、55.09%。當pH為8.0和10.0時，其提取率有所降低，但不明顯，分別為50.18%、45.05%。當pH為2.0時，其提取率明顯降低，為23.66%。因此推測該蛋白的等電點可能在4.0~6.0之間，當?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH處于等電點時，蛋白質(zhì)分子表面不帶電荷呈電中性，分子間的斥力減弱，容易受靜電引力影響聚集而產(chǎn)生沉淀[20]。

圖1 pH對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of pH on protein extraction rate

2.2.2 料液比對蛋白提取的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，蒸煮液蛋白提取率逐漸增大，料液比為1:2.5 mL/mL時，蛋白質(zhì)提取率為61.44%，相較于料液比為1:1.5 mL/mL時提升了兩倍，可知料液比對蛋白提取率影響較大。因為隨著料液比增大，蒸煮液與乙醇的接觸面積增大，提高了蛋白質(zhì)擴散速度，從而提高了蛋白提取率[21]。繼續(xù)擴大料液比，蛋白提取率變化趨于平緩，可能是因為乙醇過量，蛋白質(zhì)擴散趨于飽和，因此蛋白提取率變化不明顯。

圖2 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on protein extraction rate

2.2.3 溫度對蛋白提取的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈小幅度先升后降趨勢，在35 ℃時達到最高，原因可能是溫度過高蛋白質(zhì)開始逐步變性，因此選擇35 ℃為蒸煮液蛋白最適提取溫度。

圖3 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on protein extraction rate

2.2.4 固形物含量對蛋白提取的影響 不同生產(chǎn)廠家，不同加工批次，其蒸煮液中的固形物含量均會存在較大差異，為驗證該提取工藝的穩(wěn)定性，研究不同固形物含量對蛋白提取的影響具有重要意義。如圖4所示，固形物含量不同，蛋白質(zhì)提取率存在一定差異，但都高于60%，說明本工藝可以應(yīng)用于大部分蒸煮液樣品中蛋白的提取。

圖4 固形物含量對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of solid content on protein extraction rate

2.2.5 時間對蛋白提取的影響 由圖5可知，當提取時間為0.5~3 h時，蛋白的提取率隨著時間的延長而升高，提取時間較短，蛋白沉淀不完全。當提取時間為4 h時，蛋白的提取率略有下降，可能原因是提取時間過長導(dǎo)致蛋白分解[22]，因此選擇3 h作為最佳提取時間。

圖5 時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of time on protein extraction rate

2.3 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度、時間、料液比3個因素，按照Box-Behnken原理進行響應(yīng)面設(shè)計，試驗方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到溫度、時間、料液比的二次多項回歸方程：

Y=74.06?2.69A?0.087B+12.48C?1.26AB+2.83AC?2.58BC?3.29A2?0.63B2?9.00C2

方程的決定系數(shù)R2=0.9533，說明方程的擬合度較好，可通過二次方程對實驗結(jié)果進行分析。

由表4可知，回歸模型極顯著（P=0.0007<0.01），證明模型可靠，可以用于預(yù)測蒸煮液蛋白質(zhì)提取率。各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響大小順序為C（料液比）>A（溫度）>B（時間）。其中，模型的極顯著因子項（P<0.01）為C和C2，可知料液比對蛋白提取的影響極其顯著，與單因素結(jié)果一致。

表4 提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression model of extraction process

2.3.2 響應(yīng)面交互分析 響應(yīng)面的坡度平緩表示兩因素的交互作用不顯著，坡度較陡表示兩因素交互作用顯著。試驗中所考察的三個因素對魚蒸煮液蛋白質(zhì)提取率影響的交互作用見圖6。由圖6（a~c）可知，在三組交互作用中，AC（溫度和料液比）交互作用最強，其次是 BC（時間和料液比）的交互作用，而AB（溫度和時間）的交互作用最弱，這與表4顯著性檢驗得到的結(jié)果一致。

圖6 各因素對蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of the effects of various factors on protein extraction rate

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測與驗證 由Design-Expert 8.0軟件計算得出乙醇法提取金槍魚蒸煮液蛋白的最佳工藝條件：溫度35.77 ℃，時間2 h，料液比2.43，蛋白質(zhì)提取率為79.87%。考慮實際操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為提取溫度36.00 ℃，時間2 h，料液比2.40。采用修正后的提取條件進行實驗，實際提取率為76.83%±0.24%，實驗值與預(yù)測值在95%置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著差異，表明該響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可靠，具有實際參考價值。

2.4 蒸煮液蛋白結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 氨基酸組成分析 氨基酸是構(gòu)成生物體營養(yǎng)組分蛋白質(zhì)的基本單位，同時也是細胞生長過程中必要的營養(yǎng)成分。蒸煮液蛋白的氨基酸組成見表5，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量較高，分別為17.27%、8.09%、8.58%和10.21%，這與從金槍魚魚皮中提取的明膠相似[23]。金槍魚蒸煮液提取的蛋白的亞氨基酸含量為18.79%，與已報道的冷水魚類明膠中亞氨基酸質(zhì)量分數(shù)在17%左右[24]相符合。

表5 魚蒸煮液蛋白氨基酸分析結(jié)果Table 5 Amino acid analysis results of fish cooking liquid protein

2.4.2 紫外（UV）掃描分析 通常蛋白質(zhì)中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，這些氨基酸由于共軛雙鍵的存在，在紫外波長280 nm左右有明顯的吸收峰。而明膠中的芳香族氨基酸含量較少，使其在280 nm處的吸收峰不明顯[25]。此外，由于明膠中存在C＝O、CONH2、—COOH等發(fā)色基團，紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220 nm左右[26]。從圖7可以看出，從金槍魚蒸煮液中提取的蛋白在218 nm處有較高的吸收峰，而在280 nm處沒有明顯吸收峰，說明該提取蛋白中的芳香族氨基酸含量較少，與其氨基酸分析結(jié)果一致。

圖7 魚蒸煮液蛋白紫外掃描圖Fig.7 UV scan of fish cooking liquid protein

2.4.3 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜分析 如圖8所示，魚蒸煮液蛋白紅外光譜峰具有膠原蛋白的特征振動模式，其酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶分別出現(xiàn)在 3270.83、2934.72、1632.01、1538.75、1236.97 cm-1，與文獻中報道的虹鱒魚皮膠原蛋白的吸收峰位置一致[27]。酰胺A帶、B帶的吸收分別與NH鍵、CH2的伸縮振動有關(guān)[28]。酰胺Ⅰ帶代表C＝O的伸縮振動，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化非常敏感；酰胺Ⅱ帶與CH2和NH鍵的彎曲振動有關(guān)；酰胺Ⅲ帶與CH2的彎曲振動有關(guān)。酰胺A帶和酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶、Ⅲ帶與膠原蛋白內(nèi)部的氫鍵形成有關(guān)，反映了肽鏈的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[29]。膠原蛋白水解成明膠的過程即是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并逐漸水解的過程，蒸煮液蛋白質(zhì)在1236.97 cm-1處出現(xiàn)酰胺III帶的吸收峰，說明在蛋白質(zhì)提取時，三螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞但仍有保留[23]。此外，蒸煮液蛋白在2934.72 cm?1的吸收峰是由C-H鍵的伸縮振動引起的，1450.19 cm?1的吸收峰是由-CH-、-CH3的彎曲振動引起的，1403.37 cm?1的吸收峰是由-CH2-鍵的搖擺振動引起的，1079.53 cm?1的吸收峰是由于C-NC振動或C-O鍵的伸縮振動，這些吸收峰的存在說明魚蒸煮液蛋白質(zhì)屬于順式構(gòu)型[30]。多肽大部分肽鏈中的肽單位都是反式構(gòu)型，只有脯氨酸和羥脯氨酸的殘基肽單位是順式構(gòu)型[31]，與魚蒸煮液蛋白氨基酸組成結(jié)果相一致（脯氨酸和羥脯氨酸總質(zhì)量分數(shù)為18.79%），這也說明本實驗所制得的蛋白為明膠。

圖8 魚蒸煮液蛋白FTIR圖Fig.8 FTIR diagram of fish cooking liquid protein

2.4.4 圓二色譜（CD）分析 圓二色譜是一種根據(jù)光學(xué)活性物質(zhì)對左旋和右旋圓偏振光的吸收差異原理分析蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的方法[32]。遠紫外（190~250 nm）CD譜反映肽鍵的圓二色性，肽鍵的排列具有高度規(guī)律性，排列的方向決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況，對蛋白在此范圍內(nèi)的譜帶位置和吸收強弱進行分析可以判斷肽鏈的立體結(jié)構(gòu)信息[33]。因此，利用遠紫外CD對魚蒸煮液蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行深入分析，將蛋白溶液放入圓二色譜儀中進行光譜掃描結(jié)果如圖9所示，魚蒸煮液蛋白在198 nm附近出現(xiàn)明顯的吸收峰負峰，但是220 nm處沒有出現(xiàn)正峰。據(jù)相關(guān)文獻報道，220 nm處吸收強度可表征三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性，當?shù)鞍鬃冃曰蛘呷陕菪Y(jié)構(gòu)遭到破壞時，220 nm處吸收峰會發(fā)生變化[34]，因此結(jié)果表明本研究提取的魚蒸煮液蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)在高溫蒸煮過程中遭到破壞。

圖9 魚蒸煮液蛋白圓二色譜圖Fig.9 Circle dichrogram of fish cooking liquid protein

3 結(jié)論

采用乙醇法對金槍魚蒸煮液蛋白進行提取并分析了其結(jié)構(gòu)特性。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計，確定了金槍魚蒸煮液蛋白的最佳提取工藝條件：提取溫度36 ℃，提取時間2 h，料液比2.40，此條件下蒸煮液中蛋白的提取率可達76.83%。氨基酸組成分析結(jié)果顯示其亞氨基酸質(zhì)量分數(shù)為18.79%，其中羥脯氨酸含量為10.21%；紫外光譜顯示其在218 nm處有較高的吸收峰，而在280 nm處沒有明顯吸收峰；其紅外圖譜具有膠原蛋白紅外光譜特征吸收峰；圓二色譜說明該研究制備的金槍魚蒸煮液蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，以上結(jié)果說明采用該工藝從金槍魚蒸煮液中提取的蛋白為明膠。本研究為金槍魚蒸煮液蛋白的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。