液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS/MS)快速測定涼茶中的5種罌粟殼類生物堿

劉敏敏，謝小霞，陳 俏，胡碧波

（1.廣東省藥品檢驗所, 廣東廣州 510663；2.廣東食品藥品職業學院中藥學院, 廣東廣州 510520）

涼茶是中草藥植物性飲料的通稱，是以中草藥為原料，以中醫養生理論為指導，具有清熱解毒、生津止渴、祛火除濕等功效的飲料。近年來，不法分子受利益驅使，向涼茶中非法添加各種化學藥物以提高其功效的問題較為嚴重[1]。罌粟殼為植物罌粟的干燥成熟果殼，可用于止痛、鎮靜和止咳[2]，是國家正式公布列入麻醉品名單的管制物。罌粟殼含有20多種生物堿，其中主要成分為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等[3?4]。涼茶中非法添加罌粟殼，可增加止咳效果，但長期食用具有成癮性，可造成人的注意力下降、思維和記憶功能衰退等，長期使用還會引起精神失常，出現幻覺，嚴重時甚至會導致呼吸停止而死亡[5?6]。

目前測定罌粟殼殘留物的方法主要有酶聯免疫吸附測定法[7?8]、氣相色譜法[9?11]、高效液相色譜法[12?14]、氣質聯用法[15?17]、液質聯用法[18?22]、熒光PCR法[23?25]。其中液相色譜－質譜聯用法最為普遍，該方法靈敏度高，適用性強，可實現同時定性定量檢測，適于普及和推廣。罌粟堿類生物堿的前處理，一般采用QuEChERS法和固相萃取法[22,26?28]。這兩種方法比較復雜，操作步驟繁瑣，QuEChERS法需經有機溶劑提取、鹽析等步驟，固相萃取法需經溶劑提取、固相萃取柱吸附洗脫等步驟。

本研究以液體涼茶和固體涼茶顆粒這兩種典型基質作為研究對象，針對涼茶樣品本身的特點，建立簡單有效的樣品前處理技術，并結合液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS/MS)檢測技術，同時完成涼茶中5種主要罌粟殼生物堿的定性、定量快速檢測分析方法，并應用于實際樣品的日常監測工作中。涼茶中非法添加化學藥物的相關文獻報道較多，但涼茶中非法添加罌粟殼類生物堿的研究尚未見報道。本方法準確、快速、簡單，為涼茶的日常監督提供了科學、客觀的技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗎啡（純度≥99.8%）、可待因（純度≥97.5%）、蒂巴因（純度100%）、鹽酸罌粟堿（純度100%）、那可丁（純度100%）、罌粟殼粉 中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈 色譜純，霍尼韋爾貿易（上海）有限公司）；甲酸 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙酸 分析純，廣州化學試劑廠；乙酸銨 色譜純，廣東光華科技股份有限公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國 Millipore 公司；其他試劑 均為分析純；涼茶樣品 廣東省藥品監督管理局抽檢樣品，均來自于廣東省各地市涼茶鋪。

AB SCIEX Triple Quad 5500液質聯用儀 美國AB SCIEX公司；Milli-Q Reference實驗室純水系統 美國Millipore公司；電子天平 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；X1R低溫離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別精密稱取嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁標準品各10 mg（精確至0.1 mg）至5個10 mL容量瓶中，分別加0.5%甲酸甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，配制成濃度均為1.0 mg/mL的標準儲備液。此溶液密封后?18 ℃避光保存，有效期1年。使用時根據需要吸取適量的各化合物標準儲備液混合，用乙腈稀釋成蒂巴因、罌粟堿、那可丁質量濃度為20 μg/mL和嗎啡、可待因質量濃度為100 μg/mL的混合標準工作溶液a和蒂巴因、罌粟堿、那可丁質量濃度為2.0 μg/mL和嗎啡、可待因質量濃度為10 μg/mL的混合標準工作溶液b。混合標準工作溶液a、b密封后4 ℃避光保存，有效期6個月。

1.2.2 樣品處理 固體樣品：稱取樣品約0.5 g（精確至0.001 g），置50 mL容量瓶中，加入約25 mL含5% HCl的20%甲醇溶液，密塞，超聲處理30 min（功率250 W，頻率20 kHz），取出，放冷，加流動相定容，0.22 μm微孔濾膜過濾。取上清液，進樣，再視情況稀釋。

液體樣品：量取2 mL涼茶，置10 mL容量瓶中，加流動相定容至10 mL, 0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣，再視情況稀釋。

空白樣品溶液：取不含五種生物堿的陰性樣品，按樣品處理方法制備空白樣品溶液。

1.2.3 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；流動相：含 0.1 % 乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫（見表1），流速: 0.3 mL/min；柱溫: 40 ℃；進樣體積 5 μL。

1.2.4 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，多反應離子監測 (MRM)，正離子模式，電離電壓 (IS)：4.5kv，氣簾氣 (CUR)：275.6 kPa，碰撞氣（CAD）：62 kPa，離子化溫度（TEM）：450 ℃，輔助加熱氣 1（GS1）：344.5 kPa，輔助加熱氣 2（GS2）：344.5 kPa。5 種待測物的定性離子對、定量離子對、去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）見表2。

表2 五種化合物的定性離子對、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative pairs、quantitative pairs、de-clustering voltages and collision energies for 5 compounds

1.3 數據處理

采用AB Sciex Multi Quant 色譜數據處理軟件完成數據的采集和處理。各平行樣間數據分析采用Microsoft Excel 進行計算。

2 結果與分析

2.1 提取方法的選擇

涼茶主要包括液體涼茶和固體涼茶顆粒。涼茶中含有較多的親水性多糖、鞣質以及葉綠素。對于液體樣品，比較了乙腈提取、QuEChERS、固相萃取法、流動相提取4種方法（如圖1）。QuEChERS操作過程如下：樣品用鹽酸溶液分散均勻，用乙腈提取后，加入無水硫酸鎂和無水醋酸鈉的混合粉末鹽析處理，離心，取上清液檢測。固相萃取法操作過程如下：樣品溶液用固相萃取柱（Waters Oasis MCX 60 mg，3 mL）吸附，依次用水和甲醇洗滌，用氨化甲醇溶液（5%）洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，殘留物用流動相定容測定。實驗結果顯示，乙腈提取不完全，液面分層，回收率低；固相萃取法回收率較低，可能是因為洗脫不完全；QuEChERS法提取效率和流動相提取回收率均較高，但是流動相提取操作簡便，故采用了流動相提取。固體樣品比較了流動相、QuEChERS、固相萃取法、含5%鹽酸的20%甲醇溶液提取4種方法。結果顯示含5%鹽酸的20%甲醇溶液提取效率最高。

圖1 5種罌粟殼生物堿在采用不同提取溶劑時的提取效率Fig.1 Extraction efficiency of 5 alkaloids in different solvent

2.2 色譜柱的選擇

5種生物堿極性較大，在反相色譜柱上很難保留,一直以來是色譜分離技術的難點。目前的相關文獻報道，大都采用Hilic柱進行檢測。Hilic柱為正向色譜柱，優點是靈敏度高，缺點是受溶劑限制大，要求樣品溶劑中含有70%以上乙腈，使樣品前期的提取與純化使用的提取溶劑受到限制，且使用壽命短，價格昂貴。本實驗比較了正向色譜柱、離子交換色譜柱、反相色譜柱三種不同類型的色譜柱：Hilic柱、CR柱、亞3 μm填料核殼色譜柱（圖2）。CR柱是將多孔球形硅膠表面包覆了單層有機硅聚合物薄膜后再分別導入十八烷基和磺酸基制成的離子交換色譜柱。流動相可調節空間大，對前處理溶劑要求小，缺點是離子交換力強，相對峰形較寬；且保留時間容易發生漂移，不耐用。本實驗采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）反相色譜柱分離，取得了良好的分離效果。本實驗采用的亞3 μm填料核殼色譜柱具有Fused-core獨特核殼結構，顯著改善了色譜峰形及分離度。此色譜柱分析時的壓力僅為21.5 MPa，在常規低壓液相色譜儀上也能實現對復雜混合物的快速分離；所用2 μm入口篩板孔徑較大，避免篩板孔徑過小發生堵塞，色譜柱較耐用。

圖2 三種色譜柱的MRM色譜圖Fig.2 MRM spectra of 3 chromatographic column

2.3 流動相的選擇

本實驗對流動相進行了優化。有機相比較了甲醇和乙腈，相同梯度條件下使用甲醇作有機相，目標化合物能獲得更好的分離效果。水相比較了0.1%甲酸和0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，采用0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液分析效果較好，故本文采用含0.1 %乙酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇梯度洗脫流動相體系。

2.4 基質效應考察

基質效應(matrix effect) 是指檢測系統在分析樣品中的分析物時，處于分析物周圍的基質對分析物測定結果的影響。涼茶含有中藥材成分基質復雜，有必要對其進行基質效應考察。研究選取了固體涼茶顆粒和液體涼茶兩種基質，采用SSE% = (基質溶液標準曲線斜率/空白溶液標準曲線斜率)×100的計算方法對5種化合物的基質效應進行評價，當SSE%在80%~120%之間時，表示基質效應不明顯[24]。基質效應結果如表3。結果顯示，5種化合物在兩種基質中的SSE%值在80%~120%之間，可認為基質效應不明顯，在實際檢測過程中，可忽略不計。

表3 5種生物堿的基質效應考察Table 3 Matrix effect of 5 alkaloids

2.5 方法學驗證

2.5.1 專屬性試驗 取“1.2.1”項下混合標準工作溶液b適量，用流動相適當稀釋后按“1.2.3”“1.2.4”項條件下進樣，5種罌粟殼生物堿混合標準溶液、涼茶基質空白溶液和陽性涼茶樣品MRM結果見圖3。

圖3 混合溶液MRM色譜圖Fig.3 MRM spectra of mixed solution

配制嗎啡、可待因質量濃度為2.5、5、10、25、50、100 ng/mL，蒂巴因、罌粟堿、那可丁質量濃度為0.5、1、2、5、10 ng/mL的系列標準溶液，以峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，外標法定量。結果表明（見表4），嗎啡、可待因的線性范圍為2.5~100 ng/mL，蒂巴因、罌粟堿、那可丁的線性范圍為0.5~20 ng/mL，5種罌粟殼類生物堿的線性相關系數均大于0.995（R>0.995）。表明在相應的線性范圍內，各化合物呈良好的線性關系。

2.5.2 檢出限和定量限 分別精密量取“1.2.1”項下混合標準工作溶液b，用不含5種罌粟殼類生物堿涼茶樣品溶液稀釋，在“1.2.3”“1.2.4”項條件下進樣。按照信噪比S/N≥10計算定量限(LOQ)，S/N≥3計算檢出限(LOD)。嗎啡、可待因檢出限為0.8 μg/g，罌粟堿、蒂巴因、那可丁為0.2 μg/g，結果見表4。

表4 5種生物堿的線性關系及檢出限、定量限Table 4 Linear ranges, limits of detection（LOD）and limits of quantitaion（LOQ）of 5 alkaloids

2.5.3 加標回收試驗 以不含5種生物堿成分的涼茶樣品作為空白基質，添加高、中、低3個濃度水平的對照品溶液，按照“1.2.2”項下進行處理，結果見表5。5種生物堿成分的3個添加水平在液體基質中回收率為84.5%~105.1%, RSD不大于6.3%；固體基質中回收率為72.5%~112.3%，RSD不大于7.1%。

表5 空白樣品中5種生物堿的添加回收率（n=6）Table 5 Recovery of 5 alkaloids from blank samples（n=6）

2.5.4 精密度試驗 取混合標準品溶液在“1.2.3”“1.2.4”項條件下進樣，連續進樣6次，記錄各物質的色譜峰面積。結果顯示，5種成分的RSD值均小于0.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 樣品測定 用建立的方法對150批涼茶樣品進行了檢測，共6批檢出含有罌粟殼類生物堿（表6）。其中5批檢出含多種罌粟殼類生物堿，1批含有可待因。每批次涼茶樣品罌粟殼類生物堿總量范圍在10.96~353.81 mg/kg。

表6 實際樣品檢測結果Table 6 Actual sample test results

3 結論

本文首次對涼茶中非法添加罌粟殼進行了研究。通過對前處理方法和儀器色譜條件的優化，建立了定性、定量快速檢測涼茶中非法添加的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁等5種罌粟殼類生物堿的方法，該方法操作簡便、靈敏度高。實驗結果顯示，涼茶中非法添加罌粟殼類生物堿情況存在，且添加濃度比較大，嗎啡作為強效鎮痛藥常用量為5~15 mg，一周以上可成癮。本實驗發現嗎啡最大添加濃度達到275 mg/kg，一批樣品中所含有的罌粟殼類生物堿總量達到353.81 mg/kg，存在較大的安全隱患，應引起監管部門的足夠重視。