甘草甜素調節U14宮頸癌小鼠免疫功能及誘導凋亡的作用

王 娜，張 霞

（河北醫科大學第一醫院婦科, 河北石家莊 050000）

宮頸癌是發生于子宮的惡性腫瘤，高居女性癌癥死亡率的第2位，且全球每年新増病例約50萬，嚴重威脅女性健康[1]。化學治療是宮頸癌治療的重要方法之一，而現有的環磷酰胺、順鉑等化療藥物，長期使用會產生耐藥性，毒副作用嚴重，且治療效果也難以讓人滿意[2]。因此，新型宮頸癌治療藥物的開發迫在眉睫[3]。天然活性物質由于療效確切及較低的毒副作用，在宮頸癌治療領域受到了研究者越來越多的關注。淫羊藿苷可以通過降低Toll樣受體4/髓樣分化因子 88/核因子κB（TLR4/MyD88/NF-κB）通路和 Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）通路影響宮頸癌炎癥、凋亡、侵襲和腫瘤免疫，進而發揮治療宮頸癌作用[4]。藏紅花素通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路誘導子宮頸癌SiHa細胞自噬死亡，抑制細胞侵襲[5]。辣木生物堿具有抑制Hela細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，其分子機制與阻斷Stat3信號通路的活化有關[6]。去甲氧基姜黃素也可以明顯降低HeLa細胞異種移植模型小鼠的腫瘤重量和體積，表明其可以抑制移植瘤的生長[7]。

甘草甜素（Glycyrrhizin）為甘草的主要功效成分，作為甜味劑廣泛用于各類食品中，具有抗氧化、抗炎等作用[8]。近年來，甘草甜素的抗腫瘤作用也逐漸引起了人們的關注，其相關研究主要集中在口腔癌[9]、前列腺癌[10]、肝癌[11]等。研究發現[12]，在宮頸癌CCa細胞中，甘草甜素可以介導Notch通路的下調，誘導致宮頸癌細胞凋亡和細胞周期進程的中斷。在宮頸癌HeLa細胞中，甘草甜素能夠誘導活性氧（ROS）依賴的細胞凋亡，并使細胞周期阻滯于G0/G1期[13]。目前，甘草甜素抗宮頸癌的研究主要集中在體外作用方面，而體內抗宮頸癌研究報道較少；同時，既往的研究已經證實甘草甜素具有良好的調節免疫及誘導凋亡作用[14?15]。因此，本研究通過建立U14宮頸癌小鼠模型，探討甘草甜素是否具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，同時闡明該作用與調節免疫功能、誘導凋亡的相關性，為今后應用于臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠宮頸癌U14細胞系 購于上海賽默生物科技公司；雌性昆明種小鼠 60只，清潔級，體質量20~22 g，購于北京維通利華公司[SCXK（京）2016-0011]，在溫度為22~24 ℃、相對濕度為50%~60%條件下常規條件飼養，自由飲水和飲食，12 h光照/12 h黑暗交替；甘草甜素（含量>95%） 西安朗德生物公司，批號20200516；環磷酰胺（含量>98%） 上海邁瑞爾化學公司，批號180115；白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及干擾素-γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒 泉州睿信生物公司；TUNEL檢測試劑盒 美國羅氏公司；SYBR Green實時熒光定量PCR檢測試劑盒 美國賽默飛世爾公司；二奎啉甲酸（BCA）試劑盒 北京天恩澤基因科技有限公司；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT和磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗體 美國Abcam公司。

RD-20Ⅲ型高速冷凍離心機 日本TomySeiko公司；HEPA Class CO2培養箱 美國Thermo Fisher公司；VICTOR-1429酶標儀 美國PerkinElmer公司；UV-2100型分光光度計 上海UNICO儀器有限公司；FM-500倒置數碼熒光顯微鏡 上海普丹儀器公司；Quan Studio 3型定量PCR儀 美國賽默飛世爾公司；Mini-Protean小垂直板電泳儀 美國Biored公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模、分組及給藥 常規培養U14細胞，生長至對數期后接種于小鼠腹腔，1周處死小鼠并收集腹水。離心，細胞沉淀用生理鹽水稀釋至2×107個/mL。取0.2 mL細胞懸液接種于右側腋窩處，7 d內異種移植瘤出現表示U14宮頸癌小鼠模型建立成功[16]。將成模小鼠隨機分為模型組、甘草甜素低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg）及環磷酰胺組（25 mg/kg），每組10只，其中甘草甜素的給藥劑量參考了文獻[17]并結合預實驗結果而設定；未建模的10只小鼠設為正常組。于分組后次日開始灌胃給藥，1次/d，共21 d；正常組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。在小鼠存活狀態下，用游標卡尺分別記錄各組小鼠（n=10）在給藥第7、14和21 d的右側腋窩處瘤體積（最大直徑）。最后一次給藥24 h后，通過摘眼球法分離血清，頸椎脫位處死所有動物，立即收集瘤組織、胸腺及脾臟樣本。

1.2.2 抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數計算 取步驟“1.2.1”中分離的小鼠瘤組織、胸腺及脾臟樣本，精密稱重，分別計算抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數[16]。抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數的計算公式為：抑瘤率（%）=模型組瘤質量-藥物處理組瘤質量/模型組瘤質量×100；胸腺指數（mg/g）=胸腺質量/體質量；脾臟指數（mg/g）=脾臟質量/體質量。

1.2.3 血清 IL-2、IFN-γ和 TNF-α含量檢測 取步驟“1.2.1”中分離的血清，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，具體操作按說明書中的方法進行。

1.2.4 腫瘤組織細胞凋亡指數檢測 參考文獻[18]，用4%多聚甲醛固定腫瘤組織，經石蠟包埋后，進行4 μm厚度切片。按照試劑盒說明書中的操作指南，通過TUNEL法檢測細胞凋亡指數。凋亡指數的計算公式為：凋亡指數（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100。

1.2.5 腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達檢測 檢測方法參考文獻[19]，采用Trizol法提取瘤組織RNA，定量后取2 μg RNA并將其反轉錄為cDNA。實時定量PCR反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃、10 s， 95 ℃、5 s， 60 ℃、20 s，共40個循環。各基因引物序列由上海生工合成。Caspase-3 引物序列：5’-GGA ACC ATC ATA CAT GGA AGC G-3’，5’-TCA CCA TGG CTC AGA AGC AC-3’；Bax引物序列：5’-AAC ATG GAG CTG CAG AGG AT-3’，5’-CAG TTG AAG TTG CCG TCA GA-3’；Bcl-2 引物序列：5’-GAG GAT TGT GGC CTT CTT TG-3’，5’-ACA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）引物序列：5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’，5 ’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3’。反應結束后，采用2?△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.2.6 腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達檢測檢測方法參考文獻[20]，腫瘤組織經研磨及冰上裂解后，提取總蛋白，用BCA試劑盒進行定量。各組取等量蛋白，煮沸10 min，進行10% SDS-PAGE電泳，當溴酚藍前沿至分離膠底部時，結束電泳。轉膜，用脫脂牛奶室溫封閉 2 h；加入抗 PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT多克隆抗體，稀釋倍數均為1:1000；4 ℃下孵育過夜。洗膜后，加入相應的二抗（1:2000），室溫繼續封閉2 h，電化學發光法顯色。顯影、拍照，通過Image J分析灰度值，并計算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據處理與統計學分析，所得數據以均數±標準差“±S”表示，采用單因素方差分析及t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質量及抑瘤率的影響

在給藥初期，各組小鼠進食等行為活動正常，精神狀態良好。在給藥后期，模型組小鼠右上肢活動受限，皮毛光澤度變差，反應遲鈍，精神狀態萎靡；甘草甜素各劑量組小鼠行為活動、精神狀態等情況均好于模型組；環磷酰胺組小鼠身體消瘦，飲水、飲食活動減少；正常組小鼠各方面均無異常。

分別記錄給藥第7、14和21 d時的瘤體積（最大直徑），發現甘草甜素低、中劑量組在第14、21 d及甘草甜素高劑量組小鼠在第7、14、21 d時的瘤體積（最大直徑）均小于模型組，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；同時，甘草甜素各劑量組小鼠的瘤質量與模型組比較，均明顯降低（P<0.05或P<0.01），其抑瘤率分別為15.68%、25.41%和38.38%。與模型組比較，環磷酰胺組小鼠在第7、14、21 d時的瘤體積（最大直徑）、瘤質量均明顯降低（P<0.05或P<0.01），其抑瘤率為50.81%。結果見表1。以上結果表明甘草甜素具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，雖然其抑瘤效果弱于陽性藥物環磷酰胺，但由于較低的毒副作用，仍具有潛在的應用前景。

表1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質量及抑瘤率的影響（±S，n=10）Table 1 Influence of glycyrrhiza on tumor volume (maximum diameter), tumor weight and tumor inhibition rate in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠瘤體積（最大直徑）、瘤質量及抑瘤率的影響（±S，n=10）Table 1 Influence of glycyrrhiza on tumor volume (maximum diameter), tumor weight and tumor inhibition rate in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表4、表5同。

組別 瘤體積（最大直徑）（mm） 瘤質量（g） 抑瘤率（%）7 d 14 d 21 d正常組 — — — — —模型組 2.66±0.34 5.94±0.75 8.41±1.05 1.85±0.34 —甘草甜素低劑量組 2.47±0.43 5.23±0.70* 6.82±0.96* 1.56±0.21* 15.68甘草甜素中劑量組 2.31±0.39 5.02±0.54** 6.06±0.85** 1.38±0.23** 25.41甘草甜素高劑量組 2.06±0.28* 4.75±0.63** 5.39±0.63** 1.14±9.18** 38.38環磷酰胺組 1.98±0.24* 4.26±0.51** 4.48±0.72** 0.91±0.12** 50.81

2.2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響

調節免疫功能是天然化合物治療癌癥的主要機制之一[21]。胸腺和脾臟均為機體內重要的免疫器官，其指數可以作為機體免疫功能的重要參數。表2結果表明，與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數和脾臟指數降低（P<0.01）；與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組小鼠胸腺指數和脾臟指數升高（P<0.05或P<0.01），而環磷酰胺由于具有一定的免疫抑制作用，該組小鼠胸腺指數和脾臟指數降低（P<0.01）。在Lewis 肺癌小鼠模型中，消巖湯可以使模型小鼠的脾臟指數及胸腺指數升高，而環磷酰胺使脾臟指數及胸腺指數降低[22]，與本研究的結論相符。以上結果提示，甘草甜素在一定程度上可以促進U14宮頸癌小鼠胸腺和脾臟的發育，提高免疫功能。

表2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響（±S，n=10）Table 2 Influence of glycyrrhiza on thymus index and spleen index in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響（±S，n=10）Table 2 Influence of glycyrrhiza on thymus index and spleen index in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表3同。

組別 胸腺指數（mg/10 g） 脾臟指數（mg/10 g）正常組 26.79±3.12 81.25±7.66模型組 15.17±2.43## 56.53±7.53##甘草甜素低劑量組 20.22±3.67** 64.82±8.51*甘草甜素中劑量組 23.74±2.72** 69.60±7.23**甘草甜素高劑量組 27.61±4.14** 72.48±8.65**環磷酰胺組 11.14±1.09** 38.79±4.02**

表3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清 IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響（±S，n=10）Table 3 Influence of glycyrrhiza on serum IL-2, IFN-γ and TNF-α contents in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

表3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清 IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響（±S，n=10）Table 3 Influence of glycyrrhiza on serum IL-2, IFN-γ and TNF-α contents in U14 cervical cancer mice (±S, n=10)

組別 IL-2（ng/L） IFN-γ（ng/L） TNF-α（ng/L）正常組 6.15±0.79 2.58±0.32 130.41±16.33模型組 4.14±0.52## 2.08±0.34## 254.78±30.23##甘草甜素低劑量組 4.67±0.79* 2.52±0.35** 345.33±42.11**甘草甜素中劑量組 5.20±0.61** 2.71±0.46** 368.29±35.48**甘草甜素高劑量組 5.52±0.82** 3.13±0.26** 419.54±48.72**環磷酰胺組 4.78±0.57** 2.56±0.40** 386.61±37.35**

2.3 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量的影響

IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子在機體的抗腫瘤免疫中具有重要作用，本實驗采用ELISA法檢測了各組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，結果如表3所示。與正常組比較，模型組小鼠血清IL-2、IFN-γ明顯降低，TNF-α含量明顯增高（P<0.01）；與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環磷酰胺組小鼠血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量均明顯增加，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。IL-2可以促進 T淋巴細胞的增殖，而IFN-γ具有強大的免疫調節作用和抗腫瘤、抗病毒作用[23]。TNF-α能夠激活NK細胞或CD8+T細胞等釋放IFN-γ，抑制腫瘤細胞的生長；TNF-α也可以通過促進腫瘤細胞增殖、血管再生、腫瘤細胞侵襲等作用加速腫瘤的發生、發展，其抗腫瘤作用還存在爭議[24?25]。以上結果進一步表明，甘草甜素抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用與調節免疫功能有關。

2.4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡指數的影響

增殖與凋亡失衡會引起腫瘤，而誘導細胞凋亡是當前臨床常用抗腫瘤藥物的主要作用機理[26]。研究發現[27]，甘草甜素能夠抑制人舌癌Cal-27細胞株的增殖，并促進其凋亡。本研究通過TUNEL染色法檢測甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡指數的影響，結果如圖1所示。模型組、甘草甜素低、中、高劑量組及環磷酰胺組小鼠腫瘤細胞凋亡指數分別為（5.37%±0.85%）、（11.43%±1.54%）、（19.60%±2.12%）、（30.77%±4.48%）和（38.05%±5.19%），各給藥組與模型組比較，具有顯著性差異（P<0.01），提示甘草甜素具有誘導U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡的作用。

圖1 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡指數的影響（400×）Fig.1 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue apoptosis index in U14 cervical cancer mice (400×)

2.5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響

Caspase家族由多種與細胞凋亡相關的蛋白酶構成，在腫瘤細胞凋亡調控網絡中處于關鍵地位，而Caspase-3是最為核心的細胞凋亡執行者；Bcl-2家族由Bax等促凋亡因子和Bcl-2等凋亡抑制因子構成，廣泛參與了腫瘤的發生、發展[28]。高硯春等[29]發現，甘草甜素具有抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231生長的作用，下調Bcl-2 mRNA表達、上調Caspase-3、BaxmRNA是其發揮抑制作用的主要機制。本研究采用實時定量PCR法檢測甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響，結果如表4所示。與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環磷酰胺組小鼠腫瘤細胞Caspase-3及BaxmRNA表達增加（P<0.05或P<0.01），而Bcl-2 mRNA表達降低（P<0.05或P<0.01），進一步在分子水平證實甘草甜素具有誘導U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡的作用。

表4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響（±S，n=10）Table 4 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue Caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA levels in U14 cervical cancer mice (±S,n=10)

表4 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織Caspase-3、Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響（±S，n=10）Table 4 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue Caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA levels in U14 cervical cancer mice (±S,n=10)

組別 Caspase-3 mRNA Bax mRNA Bcl-2 mRNA模型組 0.42±0.05 0.84±0.09 1.11±0.13甘草甜素低劑量組 0.61±0.08** 0.98±0.11* 0.95±0.08*甘草甜素中劑量組 0.63±0.06** 1.06±0.13** 0.81±0.12**甘草甜素高劑量組 0.77±0.07** 1.27±0.15** 0.83±0.11**環磷酰胺組 0.86±0.10** 1.40±0.14** 0.64±0.08**

2.6 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達的影響

調控腫瘤細胞的凋亡除了與相關基因聯系密切外，PI3K/AKT信號通路在惡性腫瘤細胞的凋亡進程中也扮演著重要角色[30]。AKT受PI3K的正反饋調控影響，是PI3K的下游蛋白，為蛋白激酶，其磷酸化水平越高，證明惡性腫瘤細胞的增殖能力及抗凋亡能力就越強[31]。本研究采用Western Blot法檢測了甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達的影響，結果如圖2及表5所示。與模型組比較，甘草甜素低、中、高劑量組及環磷酰胺組小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），表明甘草甜素具有阻斷PI3K/AKT信號通路活化的作用。

表5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達的影響（± S，n=10）Table 5 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice (± S, n=10)

表5 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達的影響（± S，n=10）Table 5 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice (± S, n=10)

組別 p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT模型組 1.24±0.23 1.65±0.24甘草甜素低劑量組 0.93±0.14** 1.46±0.21*甘草甜素中劑量組 0.51±0.08** 1.32±0.15**甘草甜素高劑量組 0.37±0.05** 0.89±0.10**環磷酰胺組 0.18±0.03** 0.34±0.04**

圖2 甘草甜素對U14宮頸癌小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達的影響Fig.2 Influence of glycyrrhiza on tumor tissue p-PI3K and p-AKT expressions in U14 cervical cancer mice

3 討論與結論

多種藥物及食品中的有效成分均可以通過提高免疫力而發揮抗腫瘤作用。紅茶多酚能夠抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，其機制可能與提高抗氧化能力及增強機體的免疫調節活性有關[32]。黃酒多糖也能改善S180荷瘤小鼠的免疫功能，進而抑制腫瘤細胞增殖[33]。張夢欣等[34]的研究結果發現，甘草甜素也可以通過提高巨噬細胞百分比發揮免疫調節作用。本研究通過建立U14宮頸癌小鼠模型，灌胃給予不同劑量的甘草甜素后，發現甘草甜素可以升高胸腺指數和脾臟指數，增加血清IL-2、IFN-γ和TNF-α含量，進一步證實甘草甜素的抑瘤作用同樣與改善免疫功能有關。

誘導腫瘤細胞凋亡是天然活性物質發揮抗腫瘤作用的重要途徑[35]。本研究發現，甘草甜素各劑量組凋亡指數及Caspase-3、BaxmRNA表達均增加，Bcl-2 mRNA表達降低，表明甘草甜素具有誘導U14宮頸癌小鼠腫瘤組織細胞凋亡的作用。PI3K/AKT信號通路在腫瘤組織中異常激活，而阻斷PI3K/AKT信號通路的激活，可以加速腫瘤細胞發生凋亡，進而發揮抗腫瘤作用[36]。研究發現，甘草甜素能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制骨關節炎的發展[37]。此外，甘草甜素促進人乳腺癌MCF-7細胞凋亡及細胞周期阻滯作用也與抑制PI3K/AKT信號通路有關[38]。本研究結構同樣發現，甘草甜素低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織p-PI3K及p-AKT蛋白表達水平降低，進一步表明阻斷PI3K/AKT信號通路的活化進而誘導腫瘤細胞凋亡，是甘草甜素發揮抗腫瘤作用的潛在機制。

綜上所述，本研究發現甘草甜素具有抑制U14宮頸癌小鼠腫瘤生長的作用，且證實該作用與改善免疫功能及誘導凋亡作用有關，其在宮頸癌治療領域有潛在的應用價值。