臭氧化0.9%氯化鈉溶液治療兔VX2 腫瘤模型有效性和安全性研究

羅 榮， 王凌霄， 劉 航， 楊朝愛， 江 旭， 楊繼金

Sweet 等［1］1980 年研究報道，某些 濃度 臭氧 在不影響正常細胞情況下可抑制腫瘤細胞增殖。 魏強等［2］報道，將不同濃度醫用臭氧氣體通過瘤內注射方式注入VX2 瘤內，證實臭氧可損傷腫瘤細胞及瘤內血管內皮細胞。 臨床研究表明，放療聯合臭氧療法與單一放療相比更能改善腫瘤患者生存預后及生活質量，臭氧與5-氟尿嘧啶及順鉑聯合作用于人結腸癌細胞可起到化療增敏作用［3-5］。 研究報道，臭氧有抑瘤作用［6-8］。 因此，臭氧療法及其聯合放化療治療腫瘤具有可行性。 本實驗研究擬在超聲導引下將濃度為20 μg/mL 醫用臭氧氣體制作的臭氧化0.9%氯化鈉溶液，以2 倍于腫瘤體積劑量瘤內注射方式注入VX2 腫瘤，間隔一定時間檢測腫瘤大小、血常規及肝腎功能，驗證其治療效果，為臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 兔VX2 腫瘤模型制作

取2～2.5 kg 雄性新西蘭大白兔90 只， 經過3～5 d 飼養后開始種植 VX2 腫瘤。 VX2 瘤株取自長海醫院核醫學科傳代瘤兔，將瘤株中央壞死部分去除后，用無菌眼科剪將邊緣魚肉樣活性腫瘤組織剪成體積約為1 mm3瘤塊，接種于實驗兔后腿內側肌肉內，待腫瘤長至1～1.5 cm 時進入實驗。

1.2 臭氧化0.9%氯化鈉溶液制備及其濃度測量

實驗前24 h 將所需0.9%氯化鈉溶液30 mL 置入4℃冰箱保存，實驗開始前30 min 取出；將醫用臭氧氣體（臭氧發生器參數：濃度20 μg/mL，速率3 L/min，輸出時間20 min）通入備用0.9%氯化鈉溶液，使用多個冰袋維持其所需低溫環境；實驗用臭氧化0.9%氯化鈉溶液制作完成后，立即檢測溶液中臭氧濃度。實驗用臭氧化0.9%氯化鈉溶液中臭氧濃度為0.25～0.5 mg/L。

1.3 實驗分組及治療處理

將成功建模的72 只瘤兔以隨機數字表法均分為4 組（各18 只），靜脈麻醉后心臟采血3 mL，超聲檢測腫瘤大小并記錄最大切面長徑（a）及與之相垂直的短徑（b），按 V=1/2 ab2計算腫瘤體積。 各組處理措施： 超聲導引下A 組單次注射0.9%氯化鈉溶液，B 組單次注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液，C 組2次注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液（1 次/d，連續2 d），D 組3 次注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液（1 次/d，連續3 d），劑量均為2 倍腫瘤體積。 治療前、治療后每間隔4 d 檢測腫瘤大小及從心臟采血3 mL。

1.4 檢測指標

①腫瘤生長率： 實驗前按照前述方法檢測腫瘤大小，記錄相應長短徑，并計算腫瘤體積（V0），V4、V8、V12為 第 4、8、12 天 腫 瘤 體 積 ；V4/V0×100% 、V8/V0×100%、V12/V0×100%分別為第 4、8、12 天腫瘤生長速率。 ②血常規和肝腎功能：治療前1 h、治療后每間隔4 d 均于心臟采血3 mL，分別置于相應檢測試管， 其中生化檢測試管先置于離心機中離心（3 500 r/min×10 min）； 主要檢測： 白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血小板計數（BPC）、血紅蛋白（Hb）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、肌酐（Cr）及尿素（Urea），總膽紅素于實驗過程中均低于檢測限值。

1.5 統計學方法

2 結果

處理前各組腫瘤體積間差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 1。 各時點腫瘤生長速率比較結果顯示， 各組腫瘤在實驗周期內均不同程度增大，但B、C、D 組腫瘤生長率均明顯低于A 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C、D 組間差異均無統計學意義（P＞0.05），其中 B 組最低（效果最佳），見表 2。

表1 各組處理前腫瘤體積比較 mm3,

表1 各組處理前腫瘤體積比較 mm3,

組別 處理前腫瘤體積A 組(n=6) 340.41±206.90 B 組(n=6) 293.74±175.00 C 組(n=6) 267.69±152.36 D 組(n=6) 248.71±146.69 F 值 0.962 P 值 0.416

表2 各組腫瘤生長率比較 %,

表2 各組腫瘤生長率比較 %,

*與 A 組相比，P＜0.05

組別 第4 天 第8 天 第12 天A 組(n=6) 334.40±86.12 800.83±309.96 1 881.40±1 043.17 B 組(n=6) 221.84±68.31* 485.21±137.62* 743.71±266.10*C 組(n=6) 260.84±80.87* 598.81±263.93* 992.03±693.87*D 組(n=6) 257.27±72.18* 496.80±228.98* 991.87±493.37*F 值 6.752 4.324 3.188 P 值 ＜0.000 1 0.009 0.046

各組處理前后血常規指標（WBC、RBC、BPC、Hb）變化見表 3，肝腎功能指標（ALT、AST、Cr、Urea）變化見表4，實驗過程中各組指標均有所波動（輕度升高或降低）， 但同一時點不同組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組處理前后血常規變化

表3 各組處理前后血常規變化

檢測指標 時間點 A 組 B 組 C 組 D 組 F 值 P 值WBC/(×109/L) 第 0 天 11.02±4.16 10.28±3.19 10.53±4.53 11.84±3.14 0.586 0.626第 4 天 11.28±3.99 11.21±4.11 11.57±3.34 12.47±3.77 0.412 0.745第 8 天 10.90±3.77 10.52±3.82 12.62±4.06 11.76±4.54 0.639 0.594第 12 天 12.71±5.76 9.73±2.72 11.55±1.25 13.31±4.49 0.954 0.434 RBC/(×1012/L) 第 0 天 5.30±0.75 5.40±0.62 5.60±0.48 5.34±0.68 0.763 0.519第 4 天 5.18±0.91 5.21±0.56 5.48±0.36 5.21±0.74 0.791 0.503第 8 天 5.17±0.96 5.39±0.77 5.21±0.45 5.08±0.75 0.364 0.779第 12 天 4.99±1.07 5.22±0.45 4.78±0.56 4.86±0.82 0.383 0.767 BPC/(×109/L) 第 0 天 451.50±154.57 455.39±107.79 444.11±120.01 435.06±93.94 0.098 0.961第 4 天 512.39±207.57 424.50±129.15 469.28±103.65 442.17±151.80 1.127 0.344第 8 天 502.83±121.69 447.00±136.44 495.33±215.29 448.92±146.75 0.418 0.741第 12 天 500.67±165.57 498.67±154.79 426.33±137.57 411.50±116.65 0.632 0.603 Hb/(g/L) 第 0 天 111.39±11.78 112.83±11.86 113.94±12.49 104.17±24.62 1.341 0.268第 4 天 108.56±13.46 108.11±9.68 110.89±8.04 108.78±13.94 0.206 0.892第 8 天 111.75±14.76 110.33±12.65 106.25±9.64 105.00±14.03 0.746 0.530第 12 天 109.17±17.09 105.33±2.88 98.83±7.91 98.83±12.51 1.204 0.334

表4 各組處理前后肝腎功能變化

表4 各組處理前后肝腎功能變化

檢測指標 時間點 A 組 B 組 C 組 D 組 F 值 P 值ALT/(U/L) 第 0 天 56.61±24.20 54.61±19.58 56.33±17.75 62.56±35.15 0.343 0.794第 4 天 72.11±63.34 55.17±25.19 61.72±18.95 54.33±18.86 0.906 0.443第 8 天 60.25±26.75 60.83±24.10 54.75±16.66 50.42±16.52 0.630 0.599第 12 天 56.12±18.68 49.67±18.60 67.67±28.34 52.17±20.61 0.792 0.513 AST/(U/L) 第 0 天 56.61±24.20 54.61±19.58 56.33±17.75 62.56±35.15 0.343 0.794第 4 天 72.11±63.34 55.17±25.19 61.72±18.95 54.33±18.86 0.906 0.443第 8 天 60.25±26.75 60.83±24.10 54.75±16.66 50.42±16.52 0.630 0.599第 12 天 56.12±18.68 49.67±18.60 67.67±28.34 52.17±20.61 0.792 0.513 Cr/(μmol/L) 第 0 天 74.67±17.79 76.11±9.89 84.28±14.75 77.50±18.01 1.362 0.262第 4 天 75.67±12.97 75.20±21.39 83.94±16.56 73.67±20.92 1.154 0.334第 8 天 79.50±18.76 81.67±30.10 81.83±20.17 82.08±30.70 0.026 0.994第 12 天 67.33±17.81 79.00±9.01 76.00±13.54 66.83±10.76 1.298 0.303 Urea/(mmol/L) 第 0 天 8.18±1.23 8.25±1.42 8.99±1.29 8.52±1.89 1.362 0.262第 4 天 8.44±1.28 8.54±1.85 9.10±1.81 8.74±2.18 1.154 0.334第 8 天 10.28±1.98 9.50±4.11 10.37±4.22 10.73±3.72 0.026 0.994第 12 天 10.28±3.14 10.63±5.92 11.62±2.27 9.37±2.63 1.298 0.303

3 討論

臭氧又稱活性氧，具有強氧化性，然而其穩定性極差，易轉化為氧氣（O2）進入穩定狀態，其氣體狀態容易引起患者及操作者呼吸道毒性，因此臨床價值未得到認可；但臭氧氣體易溶解，將其溶于水后可降低呼吸道毒性且更易操作，使其研究價值再次被相關研究者重視［9］。 臭氧氣體溶于0.9%氯化鈉溶液后可形成過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-）、單態氧原子等活性氧（ROS），ROS 成分進入人體后還可形成脂質過氧化物（LPO）［10］。 研究表明腫瘤細胞缺乏超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化還原物質［11］，因此與正常細胞相比更容易受到ROS 成分攻擊。

本實驗研究顯示臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射可抑制腫瘤生長。 臭氧化0.9%氯化鈉溶液中ROS 成分進入腫瘤內可與其內蛋白質、脂質等多種成分發生反應，使相關蛋白質處于失活狀態，甚至破壞細胞完整性，從而殺傷或殺滅腫瘤細胞［12］。ROS殺傷或殺滅腫瘤細胞可通過兩種方式完成，一是調節腫瘤細胞凋亡， 二是損害腫瘤細胞線粒體功能，而損害細胞線粒體可能占主導作用，ROS 成分進入細胞內后可破壞線粒體結構，導致線粒體內信號轉導通路受破壞、能量生成受阻，最終導致腫瘤細胞損傷甚至死亡［13］。 魏強等［2］研究發現，不同濃度臭氧氣體瘤內注射后即刻使腫瘤細胞超微結構發生改變，如線粒體腫脹、內質網擴張、核周間隙增寬，甚至發生細胞膜崩解、組織結構消失等。 一些研究證實臭氧對腫瘤內細胞凋亡并無明顯影響［6，14］。 本研本研究表明， 連續2 次、3 次瘤內注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液并不能使腫瘤生長速度減慢的效果得到進一步增加，相反在各時點腫瘤生長速率似乎還略高于單次注射組。 原因可能在于：①短時間內多次刺激（靜脈麻醉、瘤內注射）造成的應激刺激腫瘤生長， 削弱了臭氧化0.9%氯化鈉溶液的抑瘤作用。早期研究顯示短暫應激產生的激素可刺激骨髓細胞，促使免疫細胞提前進入循環系統，然而應激時間過長可使循環中免疫細胞活性減低甚至調亡［15］。 有研究也證實多次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射可使腫瘤內淋巴細胞浸潤增加及相關促進血管生成因子增加［16］。 ②多次瘤內注射造成的腫瘤包膜削弱對腫瘤生長的限制作用（解剖發現腫瘤中央壞死，沿針道方向腫瘤包膜邊沿出現腫瘤生長）。 然而關于多次瘤內注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液抑瘤作用減弱的機制，還需進一步探索。

正常情況下， 正常細胞及其周圍環境中存在SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化物，少量ROS 成分進入周圍正常組織即可被其內抗氧化物質還原，從而無明顯影響。 本研究證實臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射對血常規及肝腎功能并無顯著影響。Rossmann 等［17］將一定量臭氧化蒸餾水或臭氧氣體通過不同方式（腹腔內注射、皮下注射及肌內注射等）注入瘤內或機體內研究抗腫瘤療效，發現對機體影響輕微或無明顯影響。 因此，瘤內注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液安全可行。

綜上， 臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射可安全有效地抑制腫瘤生長。 但具體機制還需進一步研究。