瑞芬太尼通過調控lncRNA SUMO1P3表達抑制腎癌細胞786-O的增殖、遷移和侵襲

趙 鋌,趙全豐,李坤慶,金 勝

(1湖北江漢油田總醫院麻醉科,潛江 433124;2湖北江漢油田總醫院骨科;3湖北文理學院附屬醫院,襄陽市中心醫院麻醉科;*通訊作者,E-mail:jinsheng123@163.com)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)又被稱為腎癌,是常見的泌尿系統惡性腫瘤。腎癌多發生于老年人,且男性患者多于女性[1]。現階段,外科手術是腎癌主要的治療手段。研究表明,手術過程采取的麻醉方式及麻醉藥物的使用可影響腫瘤細胞的惡性生物學行為和患者預后[2,3]。瑞芬太尼(remifentanil,REM)是臨床常用的麻醉藥,具有起效快、作用時間短以及時量半衰期恒定的獨特藥理學特點[4]。近年來研究顯示,瑞芬太尼可在體外抑制胃癌、結腸癌和神經膠質瘤等腫瘤細胞的增殖,并促進腫瘤細胞凋亡,表現出一定的抗腫瘤作用[5-7]。但目前,瑞芬太尼對腎癌細胞惡性生物學行為的影響還未知。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被發現與細胞增殖、轉移、凋亡和分化等過程密切相關,并參與腫瘤病理進展[8]。小泛素樣修飾蛋白1假基因3(small ubiquitin-like modifier 1 pseudogene 3,SUMO1P3)是近年來新發現的一種lncRNA,其在胃癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等腫瘤組織中表達升高,促進腫瘤發生發展[9-11]。但目前,SUMO1P3對腎癌的作用尚未可知。本研究主要探討了瑞芬太尼對腎癌786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響,以及瑞芬太尼的作用機制是否與SUMO1P3有關。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

腎癌786-O細胞購自中國科學院上海細胞庫;瑞芬太尼購自宜昌人福藥業有限公司;細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自北京索萊寶科技有限公司;逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;兔抗人細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)多克隆抗體和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體購自北京中杉金橋生物試劑;SUMO1P3的小干擾RNA(si-SUMO1P3)及小干擾RNA陰性序列(si-NC)、SUMO1P3過表達載體(pcDNA-SUMO1P3)及空載體(pcDNA)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 786-O細胞培養 786-O細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(完全培養基)培養,培養箱的濕度97%,溫度為37 ℃,并含5%CO2。

1.2.2 細胞計數試劑盒-8(CCK-8)檢測細胞增殖活性 為了檢測瑞芬太尼對腎癌786-O細胞增殖的影響,將786-O細胞以5×104個/孔接種在96孔板中,培養12 h后,棄培養基,分為對照(control)組和不同濃度(20,40,80 nmol/L)瑞芬太尼組,其中control組細胞用不含瑞芬太尼的培養基正常培養48 h,不同劑量瑞芬太尼組細胞分別使用含20,40,80 nmol/L瑞芬太尼的培養基培養48 h,利用CCK-8法檢測各組細胞增殖。各組細胞培養后,加10% CCK-8(10 μl)反應2 h,記錄酶標儀處光密度值(optical density,OD),波長450 nm。

1.2.3 Transwell檢測細胞遷移 為了檢測瑞芬太尼對腎癌786-O細胞遷移的影響,將786-O細胞以2.5×105個/孔接種在6孔板中,培養12 h,棄培養基,然后分組和處理同1.2.2。培養結束后,收集各組細胞并調整密度為5×104個/ml。將100 μl各組細胞懸液加至Transwell小室的上室,500 μl完全培養基加入下室。培養24 h后,用4%多聚甲醛、0.4%結晶紫分別固定30 min、染色15 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,顯微鏡下對隨機選取5個視野的遷移細胞計數。

1.2.4 Transwell檢測細胞侵襲 為了檢測瑞芬太尼對腎癌786-O細胞侵襲的影響,將786-O細胞以2.5×105個/孔接種在6孔板中,培養12 h后,棄培養基,然后分組和處理同1.2.2。培養結束后,收集各組細胞并調整密度為5×104個/ml。用RPMI-1640培養基以8 ∶1比例稀釋Matrigel基質膠,并鋪于Transwell上室。將100 μl細胞懸液加入有Matrigel的上室,500 μl完全培養基加入下室。培養24 h后,用4%多聚甲醛、0.4%結晶紫分別固定30 min、染色15 min。PBS清洗后,顯微鏡下對隨機選取5個視野的侵襲細胞計數。

1.2.5 蛋白印跡(Western blot)法檢測Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達 為了檢測瑞芬太尼對腎癌786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響,將786-O細胞以2.5×105個/孔接種在6孔板中,培養12 h后,棄培養基,然后分組和處理同1.2.2。培養結束后,收集各組細胞,利用Western blot法檢測細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達。利用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。在蛋白樣品中添加1×上樣緩沖液,煮沸5 min使其變性后,行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將分離蛋白轉移至偏乙烯二氟膜,用脫脂奶粉封閉2 h。然后將其置于稀釋后的Cyclin D1(1 ∶1 000)、MMP-2(1 ∶2 000)、MMP-9(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶1 000;內參)一抗孵育液4 ℃過夜。洗膜后,置于辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶5 000)孵育液室溫保持1 h。避光環境中滴加顯影液,在凝膠成像系統中曝光并拍照,Image J軟件中進行蛋白條帶分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中SUMO1P3基因表達 為了檢測瑞芬太尼對腎癌786-O細胞中SUMO1P3基因表達的影響,將786-O細胞以2.5×105個/孔接種在6孔板中,培養12 h后,棄培養基,然后分組和處理同1.2.2。培養結束后,收集各組細胞,利用RT-qPCR法檢測細胞中SUMO1P3基因表達。Trizol試劑提取細胞中總RNA,逆轉錄為cDNA后,在95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環條件下擴增。引物序列為:SUMO1P3正向:5′-ACTGGGAATGAGGAAGA-3′,反向:5′-TGAGAAAGG ATTGAGGGAAAAG-3′;GAPDH正向:5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′,反向:5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′。2-ΔΔCt法計算SUMO1P3基因相對GAPDH的表達。

1.2.7 細胞轉染 將786-O細胞以2.5×105個/孔接種在6孔板中,培養12 h后,棄培養基。利用LipofectamineTM2000試劑盒將si-SUMO1P3、si-NC、pcDNA-SUMO1P3及pcDNA分別轉染至786-O細胞。轉染4 h后,更換為完全培養基。培養24 h后,利用RT-qPCR法檢測細胞中SUMO1P3基因表達以驗證轉染效果。為了觀察沉默SUMO1P3基因表達對786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響,將轉染si-SUMO1P3、si-NC的細胞均接種至培養板中,正常培養48 h后,分別檢測細胞增殖活性、遷移和侵襲及細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達。為了觀察過表達SUMO1P3基因能否逆轉瑞芬太尼對786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響,將轉染pcDNA-SUMO1P3、pcDNA的細胞均用含80 ng/ml瑞芬太尼的培養基培養48 h,并分別記為瑞芬太尼+pcDNA-SUMO1P3組、瑞芬太尼+pcDNA組,分別檢測細胞增殖活性、遷移和侵襲及細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 瑞芬太尼對腎癌786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與對照組比較,20,40,80nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞活性、遷移數和侵襲數降低(P<0.05)。與20 nmol/L瑞芬太尼組比較,40,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞活性、遷移數和侵襲數降低(P<0.05)。與40 nmol/L瑞芬太尼組比較,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞活性、遷移數和侵襲數降低(P<0.05,見圖1,2)。

2.2 瑞芬太尼對腎癌786-O細胞Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

與對照組比較,20,40,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05)。與20 nmol/L瑞芬太尼組比較,40,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05)。與40 nmol/L瑞芬太尼組比較,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,*P<0.05;與20 nmol/L REM組比較,#P<0.05;與40 nmol/L REM組比較,&P<0.05圖1 瑞芬太尼對786-O細胞活性的影響Figure 1 The effect of remifentanil on the viability of 786-O cells

2.3 瑞芬太尼對腎癌786-O細胞中SUMO1P3基因表達的影響

與對照組比較,20,40,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中SUMO1P3基因表達降低(P<0.05)。與20 nmol/L瑞芬太尼組比較,40,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中SUMO1P3基因表達降低(P<0.05)。與40 nmol/L瑞芬太尼組比較,80 nmol/L瑞芬太尼組786-O細胞中SUMO1P3基因表達降低(P<0.05,見圖4)。

2.4 沉默SUMO1P3表達對腎癌786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-NC組比較,si-SUMO1P3組786-O細胞中SUMO1P3基因表達降低(1.08±0.09vs0.52±0.06,t=15.532,P<0.05),說明si-SUMO1P3組786-O細胞中SUMO1P3基因沉默。

與對照組比較,*P<0.05;與20 nmol/L REM組比較,#P<0.05;與40 nmol/L REM組比較,&P<0.05圖2 瑞芬太尼對786-O細胞遷移和侵襲的影響Figure 2 The effect of remifentanil on the migration and invasion of 786-O cells

與對照組比較,*P<0.05;與20 nmol/L REM組比較,#P<0.05;與40 nmol/L REM組比較,&P<0.05圖3 瑞芬太尼對786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Figure 3 The effect of remifentanil on the protein expression of Cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 in 786-O cells

與對照組比較,*P<0.05;與20 nmol/L REM組比較,#P<0.05;與40 nmol/L REM組比較,&P<0.05圖4 瑞芬太尼對786-O細胞中SUMO1P3基因表達的影響Figure 4 The effect of remifentanil on the expression of SUMO1P3 gene in 786-O cells

與si-NC組比較,si-SUMO1P3組786-O細胞活性、遷移數、侵襲數及Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達均降低(P<0.05),差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖5-7)。

與si-NC組比較,*P<0.05圖5 沉默SUMO1P3對786-O細胞活性的影響Figure 5 The effect of silencing SUMO1P3 on the viability of 786-O cells

與si-NC組比較,*P<0.05圖7 沉默SUMO1P3對786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Figure 7 The effect of silencing SUMO1P3 on the protein expression of Cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 in 786-O cells

2.5 過表達SUMO1P3逆轉瑞芬太尼對腎癌786-O細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與轉染pcDNA的786-O細胞比較,轉染pcDNA-SUMO1P3的786-O細胞中SUMO1P3基因表達升高(1.00±0.05vs3.18±0.25,t=25.652,P<0.05),說明轉染pcDNA-SUMO1P3的786-O細胞中SUMO1P3過表達。與80 nmol/L瑞芬太尼+pcDNA組比較,80 nmol/L瑞芬太尼+pcDNA-SUMO1P3組786-O細胞中SUMO1P3表達、細胞活性、Cyclin D1蛋白表達、遷移數和侵襲數及MMP-2、MMP-9蛋白表達均升高,差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖8-10)。

與80 nmol/L REM+pcDNA組比較,*P<0.05圖8 過表達SUMO1P3對瑞芬太尼處理的786-O細胞活性的影響Figure 8 The effect of SUMO1P3 overexpression on the viability of 786-O cells treated with remifentanil

與80 nmol/L REM+pcDNA組比較,*P<0.05圖9 過表達SUMO1P3對瑞芬太尼處理的786-O細胞遷移和侵襲的影響Figure 9 The effect of SUMO1P3 overexpression on the migration and invasion of 786-O cells treated with remifentanil

與80 nmol/L REM+pcDNA組比較,*P<0.05圖10 過表達SUMO1P3對瑞芬太尼處理的786-O細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響Figure 10 The effects of SUMO1P3 overexpression on the protein expression of Cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 in 786-O cells treated with remifentanil

3 討論

瑞芬太尼是一種新型的阿片類受體激動劑,常用于麻醉和鎮痛。近年來研究發現,瑞芬太尼可抑制胃癌、胰腺癌等腫瘤細胞的惡性表型,發揮一定抗腫瘤作用[12,13]。然而,瑞芬太尼是否影響腎癌細胞的惡性生物學行為,目前仍不清楚。本研究的數據顯示,20,40,80 nmol/L的瑞芬太尼作用腎癌786-O細胞后,細胞活性及Cyclin D1蛋白表達降低,表明瑞芬太尼可抑制786-O細胞增殖;同時,瑞芬太尼可降低786-O細胞遷移和侵襲數及MMP-2和MMP-9蛋白表達,表明瑞芬太尼可抑制786-O細胞遷移和侵襲。這與袁益民等[14]報道的瑞芬太尼抑制肺癌細胞增殖并誘導肺癌細胞凋亡的結果一致。

腫瘤的發生發展是一個多基因、多階段和多因素的復雜過程,探討腫瘤中異常表達的基因分子及其對腫瘤細胞惡性生物學行為的影響,可為腫瘤的靶向分子治療提供靶點。SUMO1P3是小泛素樣修飾基因(SUMO)家族成員之一,參與調控細胞的增殖、凋亡和遷移等生命過程。研究顯示,SUMO1P3在結直腸癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤中表達上調,促進這些腫瘤的惡性表型,起促癌基因作用[15-17]。但SUMO1P3基因在腎癌細胞生物行為中的作用仍有待闡明。本研究發現,沉默SUMO1P3基因后,786-O細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低,這提示SUMO1P3有可能成為腎癌治療的分子靶點。本研究還顯示,瑞芬太尼可呈劑量依賴性抑制786-O細胞中SUMO1P3基因的表達,而過表達SUMO1P3逆轉了瑞芬太尼對786-O細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,提示瑞芬太尼通過抑制786-O細胞中SUMO1P3的表達來降低其增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述,瑞芬太尼對腎癌786-O細胞的增殖、遷移和侵襲能力具有抑制作用,這與下調細胞中SUMO1P3的表達有關。但本研究僅利用體外細胞實驗進行了初步探究,尚需在體內驗證瑞芬太尼的抗腎癌作用,且SUMO1P3下游調控的基因和信號通路也有待進一步探究。