miR-3911對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響及其機制

向 楠,陳 濤,肖 麗,王 毓*,李 靜

(1山東大學附屬山東省立第三醫院婦產科,濟南 250031;2山東第一醫科大學附屬濟南婦幼保健院婦產科;*通訊作者,E-mail:wysdslyy11@126.com)

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一,也是女性腫瘤相關死亡的重要原因[1]。卵巢癌的發病率逐年上升,然而其具體發病機制并不明確[2]。探究參與調控卵巢癌發生和發展的關鍵基因,對卵巢癌的防治可能具有重要意義。微小RNA(miRNA)通過靶向作用于下游基因,影響細胞多種生物學功能如分化、轉移、增殖等,可能成為人類疾病診斷的生物標志物[3]。越來越多的證據表明,miRNA的異常表達在卵巢癌的發生和發展過程起到關鍵作用[4,5]。miR-3911由22個核苷酸構成,僅有研究報道miR-3911在常染色體顯性遺傳多囊腎病患者血清中的表達明顯下降[6]。目前miR-3911對卵巢癌細胞增殖和遷移能力影響的研究未見報道。本研究通過檢測卵巢癌細胞株中miR-3911的表達,建立miR-3911過表達細胞系,探討miR-3911對卵巢癌細胞生物學性狀的影響及相關機制,為卵巢癌的防治提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

正常卵巢上皮細胞(IOSE80)和卵巢癌細胞株(A2780、OC3、HO-8910、SKOV-3)購于美國ATCC公司;無意義序列(NC)mimic、miR-3911 mimic、NF-κB激活蛋白(NF-κB activating protein,NKAP)mRNA的3′-UTR熒光素酶重組質粒(NKAP-WT和NKAP-MUT)購于廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine 3000轉染試劑盒購于美國Invitrogen公司;實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、CCK-8試劑盒和結晶紫溶液購于上海碧云天生物技術有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司;RPMI-1640培養基、DMEM培養基購于美國Gibco公司;Transwell小室購自美國康寧公司;一抗NF-κB、p-IκBα、p-p65、GAPDH、NKAP和辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國CST公司。

1.2 細胞培養和轉染

將OC3細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,將A2780、IOSE80、HO-8910、SKOV-3細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基,于37 ℃、5% CO2環境中培養。取對數生長期的HO-8910細胞接種于24孔板,細胞融合度達到40%時,根據Lipofectamine 3000試劑盒說明書,分別將NC mimic或miR-3911 mimic轉染至HO-8910細胞,分別命名為control組和miR-3911組。培養48 h后,進行后續研究。

1.3 qRT-PCR檢測miR-3911和NKAP mRNA的表達

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA,逆轉錄獲得cDNA。根據qRT-PCR試劑盒說明書檢測miR-3911和NKAP mRNA的表達,引物設計如下,miR-3911上游引物:5′-CTCCTCCAGGATCCACACA-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;NKAP上游引物:5′-GCAGTTCGTCGAAGAGTCCG-3′,下游引物:5′-AGGCAGAAGCGAAGGGGAT-3′;β-actin上游引物:5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游引物:5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以U6為內參檢測miR-3911相對表達,以β-actin為內參檢測NKAP mRNA相對表達,按照公式2-ΔΔCt方法計算。

1.4 Western blot法檢測NKAP蛋白和NF-κB信號通路蛋白表達

分別收集轉染后的HO-8910細胞,加入細胞裂解液提取總蛋白。蛋白樣品經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉至聚偏二氟乙烯膜。在10%脫脂牛奶封閉1.5 h,加入一抗NKAP(稀釋比為1 ∶1 000)、NF-κB(稀釋比為1 ∶1 000)、p-IκBα(稀釋比為1 ∶1 000)、p-p65(稀釋比為1 ∶1 000)和GAPDH(稀釋比為1 ∶1 000),4 ℃下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋比為1 ∶3 000),在室溫下雜交2 h。滴加化學工作液,在暗室內曝光、成像。

1.5 CCK-8法檢測HO-8910細胞的增殖能力

將轉染后的HO-8910細胞按照1.5×103個/孔細胞數加入96孔板,每孔200 μl體積,每組4個復孔。培養箱內培養1,2,3,4,5 d,在每天相同時間點對control組和miR-3911組進行CCK-8檢測。加入30 μl CCK-8溶液(濃度5 g/L),培養箱內培養3.5 h,用全自動酶標儀測定每孔450 nm波長處的吸光度(A)值,繪制HO-8910細胞生長曲線。

1.6 Transwell遷移實驗檢測HO-8910細胞的遷移能力

取轉染后的HO-8910細胞,使用無血清培養基重懸后,以200 μl體積接種于Transwell上室,在下室加含胎牛血清的RPMI-1640培養基500 μl,培養箱內培養24 h。使用2%多聚甲醛固定膜下的HO-8910細胞,采用0.1%結晶紫染液染色25 min。倒置顯微鏡下隨機選擇6個視野,計數進入膜下的HO-8910細胞數。

1.7 生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗預測和驗證miR-3911的靶基因

采用靶基因預測網站microRA.org、PITA和miRTarBase預測miR-3911的靶基因。分別構建突變型和野生型NKAP基因mRNA 3′-UTR熒光素酶重組質粒(NKAP-WT和NKAP-MUT),將重組質粒與NC mimic或miR-3911轉染至HO-8910細胞。48 h后,收集并裂解HO-8910細胞,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測HO-8910細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 miR-3911在不同卵巢癌細胞株中的表達

qRT-PCR檢測顯示,正常卵巢上皮細胞(IOSE80)和卵巢癌細胞株(A2780、OC3、HO-8910、SKOV-3)中miR-3911的表達分別為1.00±0.03,0.56±0.03,0.77±0.05,0.31±0.03和0.65±0.04。與IOSE80細胞相比,卵巢癌細胞株中miR-3911表達水平顯著降低(P<0.01,見圖1),miR-3911表達最低的是HO-8910細胞(P<0.01)。因此本研究選擇HO-8910細胞株行后續實驗。

與IOSE80細胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 miR-3911在卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞中的表達水平Figure 1 The expression level of miR-3911 in ovarian cancer cells and normal ovarian epithelial cells

2.2 miR-3911 mimic轉染效率驗證

卵巢癌HO-8910細胞轉染miR-3911 mimic后,control組和miR-3911組miR-3911表達分別為1.01±0.07和12.96±1.05,miR-3911組是control組的7.29倍,差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 過表達miR-3911抑制HO-8910細胞的增殖能力

與control組相比,miR-3911組HO-8910細胞在第2,3,4,5天的吸光度A值明顯降低(均P<0.05,見圖2),提示過表達miR-3911抑制了卵巢癌HO-8910細胞的增殖。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 過表達miR-3911抑制HO-8910細胞的增殖能力Figure 2 Overexpression of miR-3911 inhibits the proliferation of HO-8910 cells

2.4 過表達miR-3911抑制HO-8910細胞的遷移能力

control組和miR-3911組HO-8910細胞遷移數分別為(107.30±10.94)個和(43.44±8.04)個。與control組相比,miR-3911組HO-8910細胞遷移能力明顯下降(P<0.01,見圖3),提示過表達miR-3911抑制了卵巢癌HO-8910細胞的遷移能力。

與control組相比,**P<0.01圖3 過表達miR-3911抑制HO-8910細胞的遷移能力Figure 3 Overexpression of miR-3911 inhibits the migration ability of HO-8910 cells

2.5 生物信息學預測miR-3911的靶基因

靶基因預測網站microRA.org、PITA和miRTarBase預測miR-3911的靶基因可能是NKAP,miR-3911與NKAP基因mRNA 3′-UTR的互補結合位點見圖4。

圖4 miR-3911與NKAP基因mRNA 3′UTR互補結合位點Figure 4 Complementary binding sites between miR-3911 and NKAP gene mRNA 3′UTR

2.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-3911與NKAP的靶向關系

雙熒光素酶報告基因檢測顯示,與共轉染NKAP-WT和NC相比,共轉染NKAP-WT和miR-3911時,HO-8910細胞相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.01,見圖5);共轉染NKAP-MUT和miR-3911時,HO-8910細胞相對熒光素酶活性無明顯改變,表明miR-3911可與NKAP基因mRNA 3′UTR靶向結合。

2.7 miR-3911靶向負調控NKAP mRNA表達

control組和miR-3911組HO-8910細胞中NKAP mRNA的表達分別為1.01±0.09和0.26±0.03,差異有統計學意義(P<0.01),表明miR-3911顯著抑制了NKAP mRNA的表達。

2.8 NKAP蛋白及NF-κB信號通路蛋白的表達

Western blot結果表明,miR-3911組HO-8910細胞NKAP蛋白表達顯著降低,NF-κB信號通路蛋白NF-κB、p-IκBα、p-p65表達降低(見圖6),表明NF-κB信號通路活化被抑制。

與共轉染NKAP-WT和NC相比,**P<0.01圖5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-3911與NKAP的靶向關系Figure 5 The dual luciferase reporter gene experiment verifies the targeting relationship between miR-3911 and NKAP

圖6 miR-3911對NKAP蛋白和NF-κB信號通路蛋白表達的影響Figure 6 Effect of miR-3911 on the expression of NKAP protein and NF-κB signaling pathway proteins

3 討論

miRNA由發夾前體miRNA經過剪接加工合成,長度為18-22個核苷酸,屬于非編碼RNA家族[7]。miRNA在各種腫瘤組織和細胞株中異常表達,作為抑癌基因或癌基因廣泛參與影響腫瘤細胞的代謝、生長、轉移、耐藥性等[8]。近年來,隨著對卵巢癌發病機制的深入研究,越來越多的miRNA被證實在卵巢癌細胞中具有特異性調節功能[9,10]。Hu等[11]報道,miR-29c-3p在順鉑耐藥的卵巢癌細胞系中表達降低,過表達miR-29c-3p可通過下調FOXP1/ATG14通路抑制順鉑耐藥細胞系的活力、自噬及耐藥性。Wei等[12]研究發現,miR-199b-3p在卵巢癌組織中表達下調,miR-199b-3p高表達患者的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)較長,過表達miR-199b-3p能夠減少卵巢癌細胞增殖并促進細胞凋亡。Zhou等[13]證實,miR-665在卵巢癌組織中高表達,其通過活化MAPK/ERK信號通路,促進卵巢癌細胞的增殖。miR-3911在卵巢癌細胞株中的表達及作用機制尚不明確。

本研究通過檢測miR-3911在卵巢癌細胞株(A2780、OC3、HO-8910、SKOV-3)和IOSE80細胞中的表達,發現卵巢癌細胞株中miR-3911的表達水平顯著低于IOSE80細胞,提示miR-3911可能在卵巢癌細胞中發揮調節作用。HO-8910細胞中miR-3911表達最低,因此選擇HO-8910細胞作為研究對象。本研究在轉染miR-3911 mimic后,HO-8910細胞增殖和遷移能力受到抑制,表明miR-3911在卵巢癌細胞中發揮抑癌基因作用。miRNA主要在轉錄后水平發揮調控作用,通過結合靶基因mRNA的3′非翻譯區,促進mRNA的降解或者阻止其翻譯[14,15]。本研究選擇靶基因預測網站microRA.org、PITA和miRTarBase預測,miR-3911與NF-κB激活蛋白(NF-κB activating protein,NKAP)存在靶向關系。NKAP蛋白是一種NF-κB活化調控蛋白,廣泛存在于神經細胞中,其在神經細胞的發育過程起到關鍵作用[16]。研究表明,NKAP蛋白在結腸癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、膠質瘤等多個腫瘤組織中高表達,促進腫瘤細胞的生長和遷移,抑制腫瘤細胞的凋亡[17,18]。本研究顯示,共轉染野生型NKAP-WT重組質粒和miR-3911 mimic,可使HO-8910細胞相對熒光素酶活性明顯降低,提示NKAP是miR-3911的靶基因。qRT-PCR和Western blot結果顯示,過表達miR-3911后,NKAP基因表達明顯降低,進一步證實miR-3911靶向負調控NKAP基因表達。NF-κB信號通路的活化顯著促進卵巢癌細胞的增殖和遷移,NKAP蛋白是NF-κB蛋白活化的重要調控因子[19-21]。NKAP蛋白表達下降后,HO-8910細胞中NF-κB信號通路蛋白NF-κB、p-IκBα、p-p65表達降低,表明NF-κB信號通路活化被抑制。

綜上所述,miR-3911在卵巢癌中發揮抑癌基因作用,通過靶向調控NKAP表達,抑制NF-κB信號通路活化,對卵巢癌HO-8910細胞增殖和遷移具有一定的抑制作用。miR-3911可能為卵巢癌的miRNA提供了新的靶向分子。