右美托咪定對急性心肌梗死大鼠心臟功能的保護作用

陳 雪,劉明潔

(首都醫科大學宣武醫院藥劑科,北京 100054)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是由于持續性冠狀動脈缺血或缺氧導致的心肌壞死[1]。臨床表現為嚴重且持續的胸骨后疼痛,伴有血清心肌酶活性增加和進行性心電圖改變,可能伴有心律不齊、心臟破裂、休克或心力衰竭[2]。隨著再灌注治療的發展,急性心肌梗死患者的缺血性心肌損害已明顯減少,但再灌注引起的心臟損傷變得越來越明顯[3]。另外,近年來,隨著溶栓和心臟介入手術的廣泛發展以及藥物治療在心肌梗死治療中的迅速發展,心肌梗死患者的預后得到了很大的改善,但由于各種原因仍有許多患者出現心肌不可逆轉的死亡,從而導致心臟功能惡化并最終導致心力衰竭[4]。

右美托咪定(dexmedetomidine)是一種新型的高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑,廣泛用于重癥監護病房和臨床麻醉[5]。研究發現右美托咪定對肺、腎和其他器官損傷均具有保護作用,并且可以減少細胞凋亡和抑制炎癥反應[6,7]。近年來,許多研究表明右美托咪定對心臟損傷具有一定的保護作用,包括減少心肌缺血/再灌注(I/R)損傷、穩定心律并減少心臟手術并發癥的發生率[8,9]。但之前研究未曾報道右美托咪定對心肌梗死的保護作用是否與調節炎癥反應、氧化應激、凋亡和自噬有關。因此,本研究探討了右美托咪定對心肌梗死大鼠心臟功能的作用,并研究了炎癥反應、氧化應激、凋亡和自噬的變化情況,為臨床治療心肌梗死提供了依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鹽酸右美托咪定注射液生產于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(中國);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)大鼠ELISA試劑盒購自聯科生物科技公司(中國);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase enzymes,CAT)和丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(中國);Bcl-2、Bax和GAPDH抗體購自Abcam公司(美國);Caspase-3和Caspase-8抗體購自Cell Signaling公司(美國);LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1抗體購自諾華生物公司(美國)。

1.2 主要儀器

小型嚙齒類動物呼吸機(型號131,NEMI,美國);MP35生理記錄儀(BIOPAC生物公司,美國);Transonic Scisense壓力測量系統(SP200,Transonic Scisense生物公司,加拿大);酶標儀(賽默飛,美國)。

1.3 動物

雄性SD大鼠40只,質量約250 g,購自首都醫科大學實驗動物中心,所有動物實驗均通過首都醫科大學動物倫理委員會的同意和批準(批準號:20200623046)。

1.4 心肌梗死大鼠模型建立

將40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、右美托咪定低劑量組(12.5 μg/kg)、右美托咪定中劑量組(25 μg/kg)和右美托咪定高劑量組(50 μg/kg),每組8只。手術前,假手術組和模型組均腹腔注射生理鹽水,右美托咪定治療組分別腹腔注射12.5,25,50 μg/kg右美托咪定,每天一次,連續10周。然后,根據之前文獻報道[10],腹腔注射氨基甲酸乙酯(1.25 g/kg)麻醉大鼠,固定于小型動物手術臺。切開氣管,插管連接小型嚙齒類動物呼吸機(15 ml/kg,60沖程/min)。用Statham P23 XL換能器將聚乙烯導管(PE-50)插入頸總動脈,連續監測心率(HR)和動脈血壓(BP)。采用標準的Ⅰ導聯心電圖記錄心律和判斷麻醉深度,使用MP35生理記錄儀獲取數據。通過左胸廓切開術暴露心臟,第四和第五根肋骨向胸骨左側約2 mm切開,心臟迅速外化并倒置。然后將6/0絲狀結扎線置于左主冠狀動脈周圍。將心臟重新放置在胸部,讓動物恢復15 min。該過程中發生心律不齊或平均血壓下降至70 mmHg以下的動物排除。將Portex P-270插管的小塑料圈套器穿過結扎線,使與心臟接觸。然后,通過拉緊結扎線閉塞左冠狀動脈,并通過釋放施加在結扎線上的張力來實現再灌注(模型組)。通過觀察動脈壓降低和ECG變化(R波增加和ST段抬高)來表明冠狀動脈結扎成功,這是缺血的標志。假手術組動物接受相同的外科手術,但未綁扎左冠狀動脈周圍的絲結扎帶。冠狀動脈閉塞30 min后,打開絲結扎帶再灌注120 min,測量指標和收集樣本。各組大鼠在手術過程中均未出現動物死亡的情況。

1.5 心肌梗死大鼠心臟功能檢測

按照文獻[11]描述,采用標準的Ⅰ導聯心電圖記錄心律,將Millar導管通過右頸總動脈插入左心室,并測定左心室收縮壓(LVSP),使用Transonic Scisense壓力測量系統連續記錄左室內壓上升最大速率(+dP/dtmax)和左室內壓下降最大速率(-dP/dtmax)。

1.6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清中炎癥因子的含量

手術后,收集大鼠血液,室溫靜置30 min,1 000 r/min離心10 min,收集上清,根據制造商說明書用大鼠ELISA試劑盒測量大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.7 商用試劑盒檢測大鼠血清中氧化應激因子含量

分離大鼠血液,使用SOD、GSH-Px、CAT和MDA試劑盒,根據制造商說明要求測量血液中SOD、GSH-Px、CAT和MDA的活性或含量。

1.8 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達水平

分離大鼠心臟,稱約50 mg,加入含有蛋白酶抑制劑的組織蛋白提取試劑,并勻漿。將勻漿液于4 ℃下以10 000g離心10 min,收集上清,采用BCA進行蛋白定量。然后,加入4×Loading buffer,于100 ℃加熱變性5 min。用SDS-PAGE分離蛋白質,并在70 V的恒定電流下電泳120 min,轉移至硝酸纖維素膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,將膜與一抗(Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和GAPDH按1 ∶1 000稀釋)于4 ℃孵育過夜。用PBST洗滌膜3次,并加入綴合有HRP的二抗(1 ∶10 000稀釋)于室溫孵育60 min。通過增強的化學發光試劑盒檢測,并通過光密度掃描定量特異性免疫反應條帶的密度。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 右美托咪定對心肌梗死大鼠心臟功能的影響

與假手術組比較,模型組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax顯著降低(均P<0.01)。與模型組比較,右美托咪定中劑量和高劑量組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax顯著升高(P<0.05或P<0.01);但各組大鼠之間心率沒有明顯差異(見圖1)。

2.2 右美托咪定對心肌梗死大鼠血液中炎癥因子的影響

與假手術組比較,模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高,抗炎因子IL-10的含量明顯降低(均P<0.01)。與模型組比較,右美托咪定中劑量和高劑量組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著降低,抗炎因子IL-10的含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。另外,與模型組比較,低劑量組大鼠血清中IL-6的含量顯著降低,IL-10的含量明顯升高(P<0.05,見圖2)。

2.3 右美托咪定對心肌梗死大鼠血液中氧化應激指標的影響

與假手術組比較,模型組大鼠血液中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著降低,MDA含量顯著升高(均P<0.01)。與模型組比較,右美托咪定中劑量和高劑量組大鼠血液中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著升高,MDA含量顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01,見圖3)。

2.4 右美托咪定對心肌梗死大鼠細胞凋亡信號蛋白表達的影響

與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax蛋白表達量明顯降低,Caspase-3和Caspase-8蛋白表達量明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,右美托咪定中劑量和高劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax蛋白表達量明顯升高,Caspase-3和Caspase-8蛋白表達量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05,見圖4)。

與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 右美托咪定對心肌梗死大鼠心臟功能的影響 (n=5)Figure 1 The effect of dexmedetomidine on cardiac function in rats with myocardial infarction (n=5)

與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 右美托咪定對心肌梗死大鼠血清中炎癥因子的影響 (n=5)Figure 2 The effect of dexmedetomidine on serum inflammatory factors in rats with myocardial infarction (n=5)

與假手術組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 右美托咪定對心肌梗死大鼠血液中氧化應激指標的影響 (n=5)Figure 3 The effect of dexmedetomidine on oxidative stress indicators in the blood of rats with myocardial infarction (n=5)

與假手術組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖4 右美托咪定對心肌梗死大鼠細胞凋亡信號蛋白表達的影響 (n=5)Figure 4 The effect of dexmedetomidine on the expression of apoptosis signaling protein in rats with myocardial infarction (n=5)

2.5 右美托咪定對心肌梗死大鼠自噬信號蛋白表達的影響

與假手術組比較,模型組大鼠組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白表達量明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較,右美托咪定中劑量和高劑量組大鼠組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白表達量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05,見圖5)。

與假手術組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖5 右美托咪定對心肌梗死大鼠自噬信號蛋白表達的影響 (n=5)Figure 5 The effect of dexmedetomidine on the expression of autophagy signaling proteins in rats with myocardial infarction (n=5)

3 討論

缺血性心臟病的持續性是全世界高死亡率和高發病率的主要原因,盡管在缺血性心臟病的治療方面已經取得了很大的進展,但缺血再灌注引起的損傷仍然限制了心肌損傷和急性心肌梗死的恢復[12]。臨床上,應用抗血小板、抗血栓、血運重建和藥物治療AMI患者,可改善心臟重塑和心肌缺血及心臟衰竭[13]。本研究發現右美托咪定通過改善心臟功能、抑制自噬和細胞凋亡信號產生心肌損傷保護作用。

心肌梗死臨床常見為冠狀動脈病變引起心肌供血不足,造成心功能障礙,如LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax降低等,本研究首先應用冠狀動脈結扎術建立了心肌梗死大鼠模型,并發現與之前文獻和臨床報道一致[10],與假手術組比較,模型組大鼠LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax降低,說明本研究成功建立了心肌梗死大鼠模型,為后續的藥物干預研究提供了基礎。另外,本研究也發現右美托咪定治療后,心肌梗死大鼠的LVSP、+dP/dtmax和-dP/dtmax顯著升高,且隨著右美托咪定劑量的增加,其治療效果愈加顯著,這說明右美托咪定對急性心肌梗死具有潛在的治療活性,后面進一步探討了其相關機制。

心肌梗死引起心肌損傷的機制很復雜,研究表明氧化應激是心肌缺血性損傷的重要原因,可導致心肌重塑[14]。另一方面,TNF-α和IL-1β通過促進巨噬細胞的過度活化和分化并刺激巨噬細胞分泌IL-6、IL-8和其他炎性因子,對心肌產生毒性作用并導致直接的心肌損傷[15]。因此,減少氧化應激和炎癥對治療心肌細胞損傷、細胞凋亡和心肌梗死具有重要意義。本研究發現右美托咪定可以降低心肌梗死大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平,發揮抗炎效果,這與之前的研究是一致的[16]。另外,本研究發現右美托咪定對心肌梗死大鼠的抗氧化系統具有調節作用,如相較于模型組,右美托咪定治療組大鼠血液中SOD、GSH-Px和CAT活性顯著升高,MDA含量顯著降低。前期研究表明右美托咪定預給藥通過調節內質網應激并減少細胞損傷,減輕了缺血后的急性心肌梗死、氧化應激和心肌損傷,從而達到了心臟保護作用[17]。上述這些說明右美托咪定對于預防和治療心肌梗死均具有潛在活性,并與抑制炎癥反應和調節氧化應激有關。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種形式,受Bcl-2家族正向和負向調節,包括前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[18]。凋亡與抗凋亡分子的比例有助于確定細胞對死亡信號的敏感性。與模型組相比,右美托咪定顯著增加了缺血30 min再灌注120 min后心肌中Bcl-2與Bax的比率,這說明模型組動物發生了細胞凋亡。許多證據表明抑制細胞凋亡可以保護心臟免受心肌I/R損傷[19]。另外,本研究也發現右美托咪定治療顯著降低了Caspase-3和Caspase-8的蛋白表達水平。這些結果表明右美托咪定通過上調Bcl-2水平并抑制細胞凋亡,從而保護心臟免受I/R損傷。

除細胞凋亡外,自噬還可能導致心肌I/R損傷,自噬在心肌I/R損傷中起雙重作用。在低水平時,自噬通過降解受損的線粒體和蛋白質聚集體而具有保護作用,而過度的自噬(如心肌I/R期間)可能由于必需蛋白質和細胞器的大量降解而對心臟功能有害[20]。依賴Beclin-1的自噬可介導心肌I/R損傷期間的自噬細胞死亡。Beclin-1蛋白表達升高誘導高水平的自噬,而Beclin-1蛋白表達的抑制與心肌I/R損傷引起的自噬減少和心肌細胞死亡減少相關[21]。本研究發現右美托咪定降低了心肌I/R損傷大鼠梗死部分的Beclin-1表達。另外,右美托咪定還通過顯著降低p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達來減輕心肌I/R損傷。在自噬啟動過程中,胞質相關蛋白LC3-Ⅰ轉化為膜結合LC3-Ⅱ形式,然后與銜接蛋白p62結合,從而促進自溶酶體中泛素化蛋白聚集體的自噬降解[22]。這些說明右美托咪定通過抑制心肌I/R損傷期間的自噬反應發揮心肌保護作用。

綜上所述,本研究發現右美托咪定對I/R損傷大鼠具有心臟功能保護作用,并與抑制炎癥反應、氧化應激和自噬有關。但右美托咪定的抗炎反應、氧化應激和自噬信號調節間是否有串聯,仍需進一步探索。