烏梅有機酸基于TGF-β/Smad信號通路對高糖誘導心肌纖維化的保護作用

代 天,劉 敏,楊 萍,姚 峰,余信強,趙 璠,張蘇川

(江漢大學附屬醫院,武漢市第六醫院心血管內科,武漢 430015;*通訊作者,E-mail:zhangsuchuan1@163.com)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常發生的一種并發癥,心肌纖維化是其致病基礎,能導致心臟順應性及收縮功能下降,引發心衰、泵衰竭、房顫等多種心臟病理癥狀[1,2]。糖基化終末產物在高糖環境中大量合成,誘導炎性因子過表達,引發炎癥,刺激心臟成纖維細胞增殖,促進膠原蛋白合成分泌,是導致心肌纖維化的主要原因,減輕炎癥是緩解心肌纖維化過程的有效方法[3,4]。烏梅是藥食同源藥材,來自于薔薇科植物梅的成熟果實,具有生津止渴、斂肺澀腸、安蛔止瀉、清咽止咳的功效,烏梅丸能顯著抑制免疫性結腸炎大鼠炎性因子表達,降低結直腸組織損傷,還可降低2型糖尿病大鼠血糖,調節腸道菌群,減輕炎癥反應,改善其臨床癥狀[5,6]。烏梅有機酸是烏梅的主要活性成分,具有抑制消炎的作用[7],但其是否可防治心肌纖維化,目前還未有明確研究。TGF-β/Smad是調控成纖維細胞增殖,組織纖維化發生發展的主要信號,在DCM病理過程中,TGF-β1表達上調,Smad3磷酸化增強,成纖維細胞活化增殖,引發心肌纖維化;阻斷TGF-β/Smad信號傳導,可抑制成纖維細胞增殖,減少膠原蛋白合成沉積,減輕心肌纖維化,改善心功能[8,9]。另有研究發現,以升陷烏梅湯干預哮喘大鼠,可抑制TGF-β1/Smad信號激活,延緩肺功能損傷[10]。但烏梅有機酸能否通過調控TGF-β/Smad信號緩解高糖誘導的心肌纖維化,目前還沒有報道,本文以烏梅有機酸處理高糖誘導的新生大鼠心肌成纖維細胞,對此進行探索研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 新生大鼠原代心肌成纖維細胞(貨號PR486),購自廣州柏賽柯生物技術有限公司;烏梅藥材(貨號XY26138),購自上海信裕生物科技有限公司;TGF-β1重組蛋白(貨號A04398),購自上海禾午生物科技有限公司;D-葡萄糖粉(貨號G8150)、DMEM低糖培養基(貨號31600)、青鏈霉素混合液(貨號P1400)、胎牛血清(貨號11011-8611)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號T1300)、CCK-8試劑盒(貨號CA1210)、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(貨號SEKR-0009)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號SEKR-0005)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(貨號P1200-50T)、高效RIPA裂解液(貨號R0010)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號PC0020),均購自美國Solarbio公司;大鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽(procollagen Ⅲ N-terminal peptide,PⅢNP)ELISA試劑盒(貨號JL20753),購自上海將來實業股份有限公司;大鼠Ⅰ型前膠原蛋白羧基末端肽(procollagen type Ⅰ carboxy-terminal peptide,PICP)ELISA試劑盒(貨號ER0322),購自武漢菲恩生物科技有限公司;兔源GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源TGF-β1一抗(貨號ab179695)、兔源Smad3一抗(貨號ab40854)、兔源p-Smad3一抗(貨號ab52903)、羊抗兔二抗(貨號ab150077),均購自美國Abcam公司等。

1.1.2 主要儀器 酶標儀(型號varioskan LUX)、凝膠成像系統(型號IBright CL 1500)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;電泳儀(型號EPS 300)、轉膜儀(型號Tanon)購自美國Bio-Rad公司等。

1.2 方法

1.2.1 細胞模型制備及烏梅有機酸濃度篩選 培養液配制:DMEM低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培養基中加入10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素溶液,混勻,即獲得細胞完全培養液;細胞完全培養液中加入D-葡萄糖粉,至葡萄糖終濃度為33.3 mmol/L[11],混勻,即獲得細胞高糖培養液。

通過CCK-8實驗測得不同濃度烏梅有機酸對原代心肌成纖維細胞增殖的影響,計算出IC50值,進而篩選出最佳作用濃度:購買的新生大鼠原代心肌成纖維細胞快速解凍,復蘇后接種于25 cm2培養瓶,平放在95%濕度、37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。取處于對數生長期的傳代細胞,以0.5×105個/ml的密度接種在96孔板,培養24 h后,更換高糖培養液進行高糖誘導,同時以終濃度0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml的烏梅有機酸[7]處理,繼續培養48 h后,更換為完全培養液,同時加入CCK-8試劑,1.5 h后于450 nm波長下測出各孔吸光度(optical density,OD),計算細胞活力,獲得IC50值,細胞活力=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。根據實驗結果選擇2 mg/ml的烏梅有機酸進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組及處理 取處于對數生長期的傳代細胞,接種在24孔板,隨機分為對照組、高糖組、烏梅有機酸(2 mg/ml)組、TGF-β1(5 ng/ml)組、烏梅有機酸(2 mg/ml)+TGF-β1(5 ng/ml)組。高糖組和用藥組細胞按照1.2.1中方法進行高糖誘導,同時烏梅有機酸組細胞以終濃度2 mg/ml的烏梅有機酸處理,TGF-β1組細胞以終濃度5 ng/ml的TGF-β1[12]處理,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞以終濃度2 mg/ml的烏梅有機酸和終濃度5 ng/ml的TGF-β1聯合處理,48 h后收集細胞及細胞培養上清液。

1.2.3 CCK-8實驗檢測各組細胞活力 取處于對數生長期的傳代細胞,以0.5×105個/ml的密度接種在96孔板,按照1.2.2中方法分組處理,通過CCK-8實驗檢測各組細胞活力。

1.2.4 各組細胞培養上清液中TNF-α、IL-6水平及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平檢測 以細胞培養上清液中PICP及PⅢNP含量來分別表示心肌成纖維細胞表達Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平。取1.2.2中收集的各組細胞培養上清液,離心取上清,以ELISA試劑盒測量其中TNF-α、IL-6、PICP及PⅢNP水平,具體操作參照各自說明書進行。

1.2.5 免疫印跡實驗檢測各組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白表達 取1.2.2中收集的各組細胞,以高效RIPA裂解液于4 ℃裂解、離心,提取總蛋白,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測出其濃度,混入適量上樣緩沖液,煮沸變性蛋白備用。運用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制分離膠及濃縮膠,取20 μg各組蛋白加入濃縮膠上樣孔中,110 V恒壓下電泳后濕轉,均用時約1.5 h,以5%脫脂奶粉封閉PVDF膜上蛋白,截取蛋白條帶分別以兔源GAPDH、TGF-β1、Smad3、p-Smad3一抗孵育、洗膜,加入羊抗兔二抗孵育、洗膜,以增強化學發光法顯影后,使用凝膠成像系統拍照,運用Quantity One軟件定量分析各蛋白表達。

2 結果

2.1 不同濃度烏梅有機酸對高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖的影響

不同濃度烏梅有機酸可抑制高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖,并隨劑量升高而作用增強,IC50為1.92 mg/ml(見圖1)。

與0 mg/ml比較,*P<0.05圖1 不同濃度烏梅有機酸對高糖誘導的心肌成纖維細胞增殖的影響 (n=6)Figure 1 Effects of different concentrations of organic acids from Fructus mume on proliferation of cardiac fibroblasts induced by high glucose (n=6)

2.2 各組細胞活力檢測結果

與對照組相比,高糖組細胞活力明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機酸組細胞活力降低(P<0.05),TGF-β1組細胞活力升高(P<0.05);與烏梅有機酸組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞活力升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞活力降低(P<0.05,見表1)。

表1 不同處理后各組細胞活力Table 1 Cell viability in each group after different

2.3 各組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平檢測結果

與對照組相比,高糖組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機酸組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),TGF-β1組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與烏梅有機酸組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05,見表2)。

表2 不同處理后各組細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6水平Table 2 TNF-α and IL-6 levels secreted by the cells in each group after different

2.4 各組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原檢測結果

與對照組相比,高糖組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機酸組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原降低(P<0.05),TGF-β1組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原升高(P<0.05);與烏梅有機酸組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原降低(P<0.05,見表3)。

表3 各組細胞表達Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原水平Table 3 The expression of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in cells in each

2.5 各組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白表達檢測結果

與對照組相比,高糖組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達明顯升高(P<0.05);與高糖組相比,烏梅有機酸組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達降低(P<0.05),TGF-β1組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達升高(P<0.05);與烏梅有機酸組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,烏梅有機酸+TGF-β1組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白p-Smad3/Smad3、TGF-β1表達降低(P<0.05,見圖2,3)。

圖2 蛋白免疫印跡檢測各組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白表達Figure 2 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group by Western blotting

3 討論

糖尿病作為一種代謝性疾病,患者因血糖長期處于高水平,而易導致DCM的發生,引發心功能障礙、心衰竭等臨床癥狀,心肌成纖維細胞的活化增殖在其中發揮著重要作用[13,14]。高糖可誘導炎癥發生,促進心肌成纖維細胞增殖,導致膠原過量沉積在細胞外,造成心肌纖維化變性[15,16]。在本實驗中,高糖可導致心肌成纖維細胞活力、分泌的TNF-α、IL-6、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原水平明顯升高,表明高糖可誘導促炎因子過量表達,引發炎癥,促使心肌成纖維細胞增殖及膠原合成,揭示本文關于研究DCM的高糖細胞模型成功建立。

與對照組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05;與烏梅有機酸組相比,&P<0.05;與TGF-β1組相比,△P<0.05圖3 各組細胞TGF-β/Smad通路相關蛋白表達Figure 3 Expression of TGF-β/Smad pathway related proteins in each group

研究表明,抑制炎癥可延緩膠原合成沉積,減輕心肌纖維化[15,16]。烏梅作為一種安全性高的重要中藥材,具有鎮咳、抗菌、抗病毒、抗炎、抗纖維化、抗氧化、降血脂、降血糖等多種藥理作用,烏梅丸可補瀉兼施、寒熱并調,減輕炎癥,對放射性腸炎具有很好的治療作用[17],烏梅湯和鹽酸二甲雙胍合用,可增強降血糖作用,改善胰島素抵抗癥狀,比各自單用療效更好[18],烏梅有機酸是提取自烏梅的有機酸類物質,可抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成,發揮明顯的抑菌作用[7]。本實驗以0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/ml濃度烏梅有機酸處理高糖誘導的新生大鼠心肌成纖維細胞,發現烏梅有機酸呈劑量依賴性地抑制心肌成纖維細胞增殖,根據IC50值,選出最佳藥物濃度,以此濃度再次處理上述細胞,發現烏梅有機酸可明顯降低細胞活力、TNF-α、IL-6、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原分泌水平,表明烏梅有機酸可抑制高糖誘導的炎性因子過表達,減少心肌成纖維細胞增殖及膠原合成分泌,緩解心肌纖維化。

TGF-β1是一種轉化生長因子,具有很強的促纖維化作用,TGF-β1可激活Smad信號,增強Smad3的磷酸化,促進膠原蛋白合成,引發組織纖維化,下調TGF-β/Smad信號通路蛋白表達,可抑制心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達,防治心肌纖維化;敲除小鼠Smad3基因,可明顯緩解心肌間質纖維化,減輕心肌不良重塑,修復心功能[19,20]。本實驗發現,以TGF-β1處理高糖誘導的新生大鼠心肌成纖維細胞,可明顯激活Smad3磷酸化,加重心肌纖維化變性,烏梅有機酸可下調細胞TGF-β1表達及p-Smad3/Smad3,而以烏梅有機酸和TGF-β1聯合處理高糖誘導的新生大鼠心肌成纖維細胞,可逆轉TGF-β1加重心肌細胞纖維化的作用,并減弱烏梅有機酸對心肌細胞纖維化的改善作用,表明烏梅有機酸可通過下調TGF-β/Smad信號通路延緩心肌纖維化。

綜上所述,烏梅有機酸可逆轉高糖誘導的促炎因子和膠原蛋白表達上調,減輕炎癥,抑制細胞外基質沉積,緩解心肌細胞纖維化,為臨床DCM的治療提供了新的參考,下調TGF-β/Smad通路是其藥理機制之一。但本研究只在細胞水平上進行了研究,存在一定不足,后續還需動物實驗進行進一步驗證,進而推廣到臨床治療中。