二甲雙胍對高脂喂養(yǎng)糖尿病大鼠心肌細胞PGC-1α及PI3K表達的影響

張 穎,徐 靜,李 楠

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院內分泌科,西安 710032;2空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院內分泌科;3西安市中心醫(yī)院內分泌科;*通訊作者,E-mail:xujingjdey85@163.com)

高游離脂肪酸血癥和高甘油三酯血癥可導致心肌脂質沉積,心肌細胞脂肪酸氧化代謝增強可直接引起心肌細胞的耗氧量增高,長脂酰輔酶A的增多,誘導細胞內超氧化簇的聚集、抑制一氧化氮合酶活性及引起心肌細胞凋亡,進而引起心室壁增厚、心室重構、從而引起心臟收縮功能障礙等。糖尿病心肌對脂肪酸的攝取和利用遠大于心肌細胞實際的氧化代謝需要,脂肪酸的過度活化可誘發(fā)心肌脂毒性,導致心肌細胞脂代謝產物和介質堆積,線粒體活性氧產生過量,進而引起糖尿病心肌肥大和功能障礙[1]。因此,脂毒性與心肌損害的發(fā)生發(fā)展密切相關。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)伴發(fā)的3個特征性代謝紊亂(高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥)也可通過各種途徑導致心肌間質纖維化的發(fā)生,與心肌能量代謝、心肌細胞胰島素敏感性亦密切相關。二甲雙胍對心血管有一定的保護作用,已被較多的循證醫(yī)學證據支持[2,3],但二甲雙胍對心肌作用機制仍需探討。過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor γ co-activator 1α,PGC-1α)作為心肌線粒體能量代謝的主要因子[4],PGC-1α在肝臟中的表達可被二甲雙胍所抑制,在肝臟中,二甲雙胍可抑制由于PGC-1α過表達導致的磷酸烯醇式丙酮酸脫羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)以及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogense,G-6-Pase)增加[5],但二甲雙胍并不影響PGC-1α介導的線粒體基因誘導。目前二甲雙胍對心肌細胞PGC-1α作用尚不明確。該研究通過觀察二甲雙胍對高脂喂養(yǎng)并且由鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的2型糖尿病(T2DM)大鼠模型心肌細胞PGC-1α及磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)p85亞基在大鼠心肌細胞表達的影響,以進一步探究二甲雙胍對糖尿病大鼠心肌細胞中胰島素信號傳導及心肌細胞能量代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心健康雄性SD大鼠36只，清潔級，體質量180-280 g，血糖正常。飼養(yǎng)于標準環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%，光照維持晝夜循環(huán)每日12 h，自由進飲食，每天換水、墊料。

1.2 動物分組及T2DM大鼠模型建立

雄性SD大鼠36只隨機分為正常對照組(12只)和2型糖尿病模型組(24只)。正常對照組喂以普通飼料，2型糖尿病模型組喂以高脂高糖飼料(基礎飼料82%，豬油10%，膽固醇2.5%，蔗糖5%，膽酸鈉0.5%)[6]，其中膽固醇、膽酸鈉購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。普通飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。豬油、蔗糖為自備。喂養(yǎng)至12周末，隔夜空腹給予2型糖尿病模型組大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg(購于美國Sigma公司，于使用前用0.1 mmol/L pH為4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液臨時配成1%的溶液)。正常對照組注射相應體積的檸檬酸緩沖液。于實驗第15周正常對照組及2型糖尿病模型組進行眼底靜脈取血，測空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)。連續(xù)兩次以上FBG≥7.8 mmol/L，計算HOMA-IR指數(shù)較正常對照組升高有統(tǒng)計學差異者，定義為伴有胰島素抵抗[7]，為造模成功，造模成功大鼠共24只。隨機抽取其中12只為糖尿病組，余12只大鼠為干預組。正常對照組和糖尿病組給予等體積生理鹽水灌胃。二甲雙胍干預組給予鹽酸二甲雙胍300 mg/(kg·d)灌胃[8]，其中鹽酸二甲雙胍由中美上海施貴寶制藥有限公司提供，共持續(xù)8周。22周末大鼠禁食水12 h后，稱重，用10%的水合氯醛按0.6 g/kg體質量腹腔麻醉，收集血液以測定空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)、游離脂肪酸(FFAs)、空腹胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。留取部分心肌組織固定于10%甲醛，供HE染色，另一部分置于-80 ℃冰箱中，供免疫印跡法檢測使用。

1.3 生化指標測定

于22周末進行生化指標測定，血糖采用羅氏血糖儀測定。總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白均按試劑盒方法操作。游離脂肪酸采用比色法測定。膽固醇、膽酸鈉購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。生物試劑盒購自南京建成生物工程研究所，游離脂肪酸試劑盒購自英國RANDOX公司。胰島素采用酶聯(lián)免疫法測定，鼠胰島素檢測試劑盒購自美國R&D公司。

1.4 HE染色

經固定、脫水、制作蠟塊、切片脫蠟、染色過程，于光鏡下放大至高倍，照相。

1.5 免疫印跡法(Western blot法)檢測蛋白表達

心肌組織總蛋白提取后，取上清液分裝于離心管中并置于-20 ℃保存。將樣品放置于生物分光光度計(NanoDrop ND-1000)比色分析，計算含50 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液與蛋白樣品按1 ∶4混勻。SDS-PAGE電泳后轉膜，用TBST將一抗稀釋至適當濃度，放入1.5 ml離心管中；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，將抗體溶液加到保鮮膜上；其中PI3K p85多克隆抗體購自美國SCT生物技術公司。PGC-1α多克隆抗體購自英國Abcam生物技術公司。從封閉液中取出膜，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角趕出殘留氣泡；放入冰箱內4 ℃孵育過夜。第2天取出膜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。室溫下封閉1 h。4 ℃封閉過夜。凝膠成像系統(tǒng)拍照，進行密度值測定。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠的一般情況

正常對照組12只大鼠普通飼料喂養(yǎng)，毛發(fā)光潔、精神狀態(tài)良好、生長發(fā)育正常；2型糖尿病模型組大鼠高脂高糖喂養(yǎng)過程中，毛發(fā)易脫落、豎立無光澤，反應遲鈍、精神萎靡、生長發(fā)育遲緩。第15周用STZ誘導糖尿病大鼠模型成功后，2型糖尿病模型組24只大鼠在原有特殊癥狀的基礎上，出現(xiàn)了多飲、多食、多尿、腹瀉、消瘦癥狀明顯。第15周至22周末進行藥物干預過程中，正常對照組和糖尿病組僅使用生理鹽水灌胃，各自特征較前無特殊改變，其中糖尿病組2只于20周自然死亡；二甲雙胍干預組大鼠腹瀉較其他組嚴重，余多飲、多尿癥狀好轉，其中2只于21周因灌胃死亡。

2.2 血糖、血脂、游離脂肪酸、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的比較

實驗室第15周測空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)，連續(xù)兩次以上FBG≥7.8 mmol/L，HOMA-IR指數(shù)較正常對照組升高有統(tǒng)計學差異者定義為伴有胰島素抵抗，為造模成功(見表1)。22周末測糖尿病組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINS、HOMA-IR指標均較正常對照組大鼠升高(P<0.01)，HDL-C指標較正常對照組降低(P<0.01)；干預組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINS、HOMA-IR指標均較糖尿病組降低，HDL-C指標較糖尿病組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表2)。

表1 第15周兩組大鼠HOMA-IR指標的比較Table 1 Comparison of HOMA-IR of rats between two groups at week

表2 22周末各組大鼠生化指標的比較Table 2 Comparison of the biochemical index of rats between groups at the end of 22

2.3 免疫印跡法結果

與正常對照組比較，糖尿病組PGC-1α表達升高(P<0.05)；與糖尿病組比較，干預組PGC-1α表達降低(P<0.05)。與正常對照組比較，糖尿病組PI3K p85表達降低(P<0.05)；與糖尿病組比較，干預組PI3K p85表達升高(P<0.05，見圖1)。

2.4 HE染色結果

22周末取大鼠心肌組織固定于10%甲醛，行HE染色。正常對照組心肌細胞排列整齊、致密，結構清晰，細胞核形態(tài)規(guī)則。糖尿病組，可見心肌細胞排列不整齊，心肌細胞腫脹明顯，部分細胞核可見形態(tài)不規(guī)則；心肌細胞部分融合，邊界不清楚。二甲雙胍干預組，心肌細胞形態(tài)排列較整齊，未見明顯細胞腫脹，核形態(tài)較規(guī)則(見圖2)。

與正常對照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05圖1 各組心肌組織PI3K p85、PGC-1α表達免疫印跡法結果Figure 1 Western blotting results of PI3K p85 and PGC-1α expression in myocardial tissues in each group

圖2 22周末各組心肌組織HE染色結果Figure 2 HE staining results of myocardial tissue in each group at the end of 22 weeks

3 討論

3.1 脂毒性心肌病與胰島素抵抗

脂肪酸的攝取和利用不相平衡，造成脂質氧化不充分，不能充分氧化的脂質在心臟沉積，導致心肌功能障礙或心肌肥厚，進而形成脂毒性心肌病[9]。糖尿病患者血漿中FFAs和TAGs水平升高和心肌細胞脂質積聚均為糖尿病性心肌病發(fā)展的必然經過。心肌細胞胰島素抵抗是心肌病發(fā)生的一個重要原因。胰島素抵抗使心肌細胞利用葡萄糖氧化來提供的能量減少，從利用葡萄糖和脂肪酸供能轉變幾乎全部通過脂肪酸β-氧化提供能量[10]。糖尿病患者心臟長期處于高血糖、高血脂的代謝環(huán)境，促進大量基因序列的改變，主要涉及有關免疫反應、細胞信號通路、增殖及轉錄的基因，繼而引起一系列細胞結構和功能的變化[11]。因此，脂毒性與胰島素抵抗始終互為因果。本實驗是在首先誘導動物出現(xiàn)胰島素抵抗的基礎上再注射小劑量STZ，兩者結合起來更加有利于誘導出病理、生理方面改變都接近于人類的2型糖尿病，實驗中大鼠經高脂高糖喂養(yǎng)后，出現(xiàn)了明顯的高脂血癥，模型組大鼠膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白及游離脂肪酸、胰島素抵抗指數(shù)均出現(xiàn)明顯升高，高密度脂蛋白明顯降低，是研究2型糖尿病之毒性、胰島素抵抗的理想模型，通過HE染色后亦可見糖尿病組大鼠心肌的病理形態(tài)學改變。

3.2 PI3K-Akt途徑與心肌細胞的胰島素敏感性

PI3K-蛋白激酶B(Akt/PKB)途徑介導胰島素的大部分生物效應，是胰島素調節(jié)細胞生理功能的主要信號通路，可調節(jié)葡萄糖攝取、促進細胞分裂、增生及生存、抗凋亡、激活多個基因表達等，PI3K-Akt-mTOR通路是目前研究熱點，可調節(jié)多種細胞的生理活動，包括細胞的生長、增殖和分化，其過度激活參與糖尿病心肌病、糖尿病腎病、胰島素抵抗等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下大鼠心肌組織有PI3K的表達，但2型糖尿病組PI3K的表達較正常組明顯減低，提示PI3K的表達與2型糖尿病心肌細胞胰島素敏感性降低密切相關。在參與基因調控方面，分析可能是由于PI3K的表達減低，導致下游因子Akt的表達變化，由于Akt處于PI3K/Akt通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K的直接靶基因。許多細胞因子、生長因子和物理刺激等都可通過激活PI3K而使Akt磷酸化，活化的Akt引起下游磷酸化級聯(lián)反應和靶蛋白之間的相互作用，調控細胞生長與存活、增殖與凋亡，糖類代謝，基因轉錄等多種細胞活動和生物學效應，而PI3K的表達直接影響下游因子的表達變化。因此，PI3K表達增加可促進外周組織的糖利用，減輕胰島素抵抗，增強將葡萄糖作為能量來源的能力，使心臟供能加強并防止心功能不全，而PI3K表達下降則影響心肌細胞生理活動。

3.3 PGC-1信號傳導途徑在心肌代謝中起關鍵作用

在復雜的轉錄途徑的主要成分中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)起關鍵作用，作為代謝傳感器，負責轉錄的微調對過多刺激的反應[13]，并且調節(jié)心肌細胞糖酵解到有氧氧化的代謝轉換。PGC-1α表達增多明顯加強脂肪酸的氧化，并發(fā)生在糖酵解的肌肉中[14]。本實驗經過高脂喂養(yǎng)并通過STZ誘導的糖尿病大鼠模型中，PGC-1α表達水平升高。PGC-1α表達加強脂肪酸β-氧化，而利用葡萄糖和脂肪酸供能轉變幾乎全部通過脂肪酸β-氧化提供能量為糖尿病心肌病發(fā)生的重要機制之一。此外，低氧刺激PGC-1α表達，而后PGC-1α與核受體相互作用，增加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌[15]。我們推測PGC-1α的表達增加,加強糖尿病心肌細胞由葡萄糖供能轉變?yōu)橹舅嵫趸┠埽赡転椴焕蛩亍４送猓琍GC-1α在決定線粒體含量中起主要作用。線粒體增生失控，導致線粒體數(shù)量和體積驟增，同時伴有線粒體生物發(fā)生相關基因的上調；或許已有線粒體超微結構破壞和病理心肌的發(fā)生[16]。綜上所述，我們可以推測PGC-1α在心肌細胞中的表達增加可能引起線粒體的增生，數(shù)量與體積劇增。線粒體含量的任何增加都會以肌原纖維體積增大為代價，從而使心肌肥大，進一步發(fā)展可導致心臟功能失代償。

3.4 二甲雙胍的心血管保護作用

作為2型糖尿病治療一線治療藥物，許多循證醫(yī)學證據表明，二甲雙胍除了能夠降低血糖，改善胰島素抵抗之外，還具有心血管保護作用，能夠減輕缺氧、缺血再灌注損傷、減少心肌細胞凋亡。保護血管內皮、延緩心肌纖維化、改善心肌肥厚的積極作用。二甲雙胍能夠通過PI3K-Akt依賴途徑誘導Akt磷酸化抑制線粒體通透性轉運體(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放來減輕缺血再灌注損傷[17]。近期有文獻報道二甲雙胍還可以激活Akt1并使JNK3及c-Jun磷酸化水平降低，達到抑制細胞凋亡改善缺血再灌注損傷。其具體分子機制是經由PI3K-Akt-mTOR途徑介導抑制缺血心肌細胞凋亡、促進心肌存活，對大鼠心肌細胞發(fā)揮正性肌力作用[18]。從本實驗可以看出，二甲雙胍組較糖尿病組PI3K表達升高，說明二甲雙胍可以通過PI3K-Akt介導的途徑對糖尿病心肌細胞發(fā)揮作用。此外，本實驗中二甲雙胍干預后心肌細胞PGC-1α表達較糖尿病組降低，提示二甲雙胍可能通過PGC-1α表達的減少，減少脂肪酸β-氧化，加強葡萄糖供能，改善心肌代謝。同樣近期有研究結果顯示大鼠梗死心肌中PGC-1α的蛋白質表達水平上調，細胞凋亡率上升，二甲雙胍干預后，PGC-1α蛋白質表達水平下降，細胞凋亡率提升[19]，研究結果與本實驗一致。

綜上所述，二甲雙胍干預組大鼠的血脂相關生化指標及胰島素抵抗指數(shù)均較糖尿病組有明顯改善，可改善脂毒性及胰島素抵抗。可能通過抑制大鼠心肌細胞PGC-1α表達，同時上調大鼠心肌細胞PI3K p85的途徑完成，改善心肌能量代謝，增強心肌細胞的胰島素敏感性。PGC-1α與PI3K-Akt途徑之間的調節(jié)機制，其下游因子之間的相互作用，仍需進一步研究，進而更深入地研究糖尿病心肌病機制及二甲雙胍對2型糖尿病患者心臟保護作用機制。