遠端缺血后處理對對乙酰氨基酚源性急性肝損傷小鼠的保護作用

常虎林，黨 珊，張智勇，萬 永，劉司南，鄭 偉*

(1陜西省人民醫院肝膽外科，西安 710068；2陜西省人民醫院老年消化科；3西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科；*通訊作者,E-mail:zhengwei_xa@163.com)

對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是臨床廣泛使用的解熱鎮痛藥物，其過量服用會導致嚴重的急性肝損傷。目前已上升為歐美及我國部分地區急性肝衰竭的主要病因[1]。

遠端缺血后處理(remote ischemic postconditioning,RIPoC)是指在器官組織發生缺血后長時間再灌注前通過反復短暫對非重要組織器官進行缺血再灌注來達到保護缺血組織器官的措施，目前已有研究發現RIPoC對心、腦、腎缺血再灌注損傷發揮保護作用[2]。但RIPoC能否緩解APAP誘導的急性肝損傷尚有待研究。本研究通過構建APAP藥物性肝損傷小鼠模型，探討RIPoC對APAP藥物性肝損傷小鼠的保護作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

6-8周、體質量約20 g的C57BL/6雄性小鼠，許可證號：SYXK(陜)2016-006；SPF級，由陜西省人民醫院實驗中心提供。HO-1抗體由購自美國Abeam公司。NF-κB抗體購自美國Santa Cruz公司。TNF-α和IL-6檢測試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。GSH測試盒、MDA測試盒由南京建成生物工程研究所提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技術有限公司提供。APAP溶液的配制(將0.6 g APAP粉劑溶于100 ml生理鹽水中，在40 ℃水浴鍋中晃動充分溶解、混勻，按300 mg/kg即50 ml/kg的劑量給藥準備，每只小鼠約20 g，平均給藥劑量約1 ml)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和模型制作 6-8周齡BALB/c雄性小鼠(22-25 g)40只，按隨機數字表法分4組：①空白對照組(不做任何處理)；②假手術組，小鼠腹腔注射1 ml生理鹽水后，行遠端缺血后處理；③肝損傷組，腹腔注射1 ml APAP溶液；④肝損傷+遠端缺血后處理組，小鼠腹腔注射1 ml APAP溶液后，行遠端缺血后處理。各組小鼠均在APAP暴露16 h后處死，及時采集血液樣本和肝組織樣本。

遠端缺血后處理方法[3]：小鼠麻醉采用25 mg氯胺酮和2.5 ml甲苯噻嗪混合，給藥劑量5 ml/kg。選取肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠，腹腔注射1 ml的APAP溶液后，取無彈性棉質繩帶捆綁結扎小鼠右后肢中上部5 min造成肢體缺血后，再松開繩帶，讓血液再灌注5 min,重復上述操作4個循環。可通過足部的顏色及下肢股動脈搏動情況來顯示血液流動情況進而評價遠端局部缺血的效果。

1.2.2 肝指數測定 稱取各組小鼠體質量和肝臟質量，計算肝臟指數(肝體質量/小鼠體質量×100%)。

1.2.3 血清ALT、AST水平的測定 各組小鼠眼球取血后，置于冰上30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據檢測試劑盒說明書指示，測定血清ALT、AST水平。

1.2.4 肝組織病理學檢查 取出分離后的肝臟組織利用4%甲醛溶液固定,常規蘇木精-伊紅(H&E)染色,觀察肝組織病理學改變。

1.2.5 血清炎癥相關因子和氧化應激程度的測定 根據ELISA檢測試劑盒說明書指示，測定血清TNF-α、IL-6含量和肝組織GSH、MDA含量。

1.2.6 肝組織NF-κB和HO-1蛋白的測定 精密稱取各組小鼠肝組織，根據RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肝組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5 μl，用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨。在冰上裂解25 min后，14 000g離心30 min，取上清，利用Western blot檢測各組小鼠肝組織NF-κB和HO-1表達的變化，應用β-actin作為內參校正。

1.2.7 統計學處理 所有數據以均數±標準差形式表示。采用SPSS17.0軟件進行正態檢測，方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析，非正態分布數據經正態轉換后再進行統計學處理,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠肝指數的影響

與對照組和假手術組比較，肝損傷組小鼠肝指數明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠肝指數較肝損傷組下降，差異有統計學意義(P<0.05，見圖1)。

2.2 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響

肝損傷組小鼠血清ALT、AST水平明顯高于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠血清ALT、AST水平明顯低于肝損傷組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2)。

與空白對照組和假手術組比較，*P<0.05；與肝損傷組比較，#P<0.05圖1 實驗各組小鼠肝指數水平Figure 1 Liver index level in each group

2.3 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠肝組織形態學變化

光鏡下對照組和假手術組肝臟標本組織形態大致正常，無明顯差異；而肝損傷組肝小葉結構破壞嚴重，肝細胞腫脹，排列紊亂，可見點片狀壞死，炎性細胞浸潤明顯；而肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠肝組織損傷程度則明顯減輕(見圖3)。

與空白對照組和假手術組比較，*P<0.05；與肝損傷組比較，#P<0.05圖2 實驗各組小鼠血清ALT和AST水平Figure 2 Serum ALT and AST levels in each group

圖3 實驗各組小鼠肝組織病理形態 (HE染色，×200)Figure 3 Hepatic histopathology of mice in each group(HE staining, ×200)

2.4 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠炎癥因子的影響

肝損傷組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯均高于對照組和假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠血清TNF-α和IL-6水平均明顯低于肝損傷組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

2.5 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠氧化應激的影響

與對照組和假手術組比較，肝損傷組肝組織GSH含量降低(P<0.05)，而肝損傷+遠端缺血后處理組小鼠中GSH含量較肝損傷組則明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；肝損傷組MDA含量明顯升高，肝損傷+遠端缺血后處理組較肝損傷組則顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，見圖5)。

2.6 RIPoC對APAP誘導急性肝損傷小鼠肝組織NF-κB、HO-1表達的影響

相較于對照組和假手術組，NF-κB蛋白表達水平在肝損傷組小鼠中顯著升高(P<0.05)，在肝損傷+遠端缺血后處理組中其表達水平又顯著回落，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，肝損傷+遠端缺血后處理組HO-1蛋白水平較肝損傷組更高，差異有統計學意義(P<0.05，見圖6)。

與空白對照組和假手術組比較，*P<0.05；與肝損傷組比較，#P<0.05圖5 實驗各組小鼠肝GSH和MDA活性Figure 5 GSH and MDA activities in each group

與空白對照組和假手術組比較，*P<0.05；與肝損傷組比較，#P<0.05圖6 實驗各組小鼠NF-κB和HO-1蛋白表達情況Figure 6 The expression of NF-κB and HO-1 protein in each group

3 討論

APAP誘導急性肝損傷是一個復雜的病理過程。一般認為超限量的APAP會使葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑飽和，產生過量N-乙酰-對-苯醌亞胺(NAPQI)，耗竭完體內GSH，產生過量的活性氧(ROS)和強烈的脂質過氧化反應[4]，脂質過氧化產物MDA增多，同時肝內枯否(Kupffer)細胞和單核細胞被激活，釋放大量的TNF-α和IL-6等[5]，加劇肝臟的損傷，最終導致肝細胞死亡。

RIPoC能有效調動機體內源性保護機制以減輕臟器缺血再灌注損傷，其具體的保護機制可能跟神經機制、體液因素、炎癥反應、靶器官血流量等有關。目前已在缺血性腦卒中、心肌梗死、急性腎損傷等疾病的治療中展現了良好的輔助作用[6,7]。

本研究采用APAP制備急性肝損傷小鼠模型。結果表明，與對照組和假手術組比較，肝損傷組小鼠肝組織小葉結構破壞嚴重，壞死區域增多，炎性細胞浸潤明顯，充血水腫，肝指數升高，ALT、AST含量明顯升高，提示APAP誘導急性肝損傷模型制備成功。而肝損傷模型中炎癥相關因子TNF-α、IL-6和脂質代謝產物MDA異常增多，抗氧化物質GSH含量的消耗，與文獻報道一致[4,5]，進一步證實了炎癥反應和氧化應激的失衡是導致肝損傷中的重要原因。本研究參照文獻[3]實施遠端缺血后處理。結果表明，與肝損傷組比較，肝損傷+遠端缺血后處理組肝組織炎性細胞浸潤和壞死程度明顯改善，肝指數降低，ALT、AST、TNF-α、IL-6、MDA含量降低，GSH含量升高，提示遠端缺血后處理可減輕小鼠APAP性急性肝損傷，降低炎癥反應和氧化應激程度。

既往研究報道[8]，生理狀態下NF-κB存在于細胞胞漿中，是許多炎癥相關基因轉錄過程中的關鍵調節因子，在細胞炎癥反應中發揮“開關”作用。HO-1是血紅素的限速酶和關鍵酶，作用廣泛，具有抑制細胞凋亡、抗氧化和抗炎作用[9]。本研究中，我們采用Western blot法測定各組小鼠肝組織NF-κB、HO-1的蛋白表達水平。研究發現，與對照組和假手術組比較，肝損傷組小鼠肝組織p-NF-κB P65表達上調，而RIPoC處理可下調p-NF-κB P65的表達，同時顯著上調HO-1蛋白的表達水平。

綜上，RIPoC對APAP誘導急性肝損傷有一定的保護作用，其抗炎、抗氧化作用可能與抑制NF-κB的激活和促進HO-1的表達有關。更全面的分子機制仍需進一步深入研究。