骨髓間充質干細胞通過抑制破骨細胞相關因子改善膝關節骨性關節炎

馮 唱,李克文,扎西達娃,張斌斌,季健坤,趙宏濤,陸 川,楊森林

(青海大學附屬醫院關節外科,西寧 810000;*通訊作者,E-mail:QDFYkwl@126.com)

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是膝關節軟骨的變性、破壞及關節周圍骨質增生為特征的慢性關節病,高達10%的60歲以上的人患有KOA,由于關節軟骨自我修復能力有限和人口老齡化,KOA在許多國家的發病率呈上升趨勢[1]。其特征是由于細胞外基質的喪失、廣泛的纖維化和裂隙的形成而導致的關節軟骨退變,最終導致軟骨表面的完全喪失[2]。雖然一些藥物如非甾體抗炎藥(NSAIDs)和細胞外基質成分透明質酸可以通過改變軟骨下骨和滑膜來緩解KOA的癥狀,但由于KOA的復雜病理和慢性性質,目前還沒有有效的治療方法,且許多KOA患者在疾病后期需要關節置換治療,但假體的壽命是有限的[3]。因此尋找積極的KOA治療方法非常必要。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種來源于骨髓的間充質干細胞,作為具有多向分化潛能的干細胞,BMSCs可以分化為不同類型的組織,包括軟骨和骨骼,此外,BMSCs還可以進行自我更新并產生免疫調節反應[4,5]。因此,BMSCs在軟骨損傷和關節疾病的治療中得到了積極的應用。盡管BMSCs已經用于治療關節炎,但BMSCs治療KOA的具體機制尚不清楚,有研究者懷疑BMSCs通過分泌一系列免疫因子和細胞因子發揮作用,進而發揮免疫調節和抗炎作用[6]。此外,在低氧環境培養MSCs期間,細胞表現出一套獨特的分化、增殖和衰老特性[7]。基于此,本研究擬通過建立KOA動物模型,將BMSCs在缺氧條件下共培養,研究BMSCs預處理對KOA的治療作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠40只,體質量160-180 g,購自四川大學華西醫院,使用許可證號:SYXK(川)2018-119,飼養于恒溫20-25 ℃、恒濕(50%±5%)環境中,自然采光,自由飲水。大鼠適應性飼養1周后,其中32只隨機分為4組:空白組、模型組、甲氨蝶呤組和骨髓間充質干細胞組(BMSCs組),每組8只,剩余8只大鼠用于骨髓間充質干細胞的分離。

1.2 主要試劑及儀器

L-DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco;木瓜蛋白酶(S10011;CAS:9001-73-4)購自上海源葉生物科技有限公司;蘇木素染液(批號:ZH193907)購自武漢賽維爾生物技術有限公司;伊紅染液(批號:C200403)購自珠海貝索生物技術有限公司;核因子κB受體活化因子配基(RANKL,貨號:ZC-36698)、骨保護素(OPG,貨號:ZC-36651)、CXC趨化因子配體10(CXCL10,貨號:ZC-M6646)ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司;RNA Trizol Reagent(批號vs18061730)購自合肥博美生物科技有限責任公司;TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(貨號RR820A)購自北京寶日醫生物技術有限公司;抗RANKL(貨號:ab239607)、OPG(貨號:ab73400)、TRAF6(貨號:ab33915)、CXCL10(貨號:ab214668)、CXCR3(貨號:ab71864)抗體購自英國Abcam;BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0009)購自上海碧云天生物技術有限公司;BMJ-A型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠);BA210Digital數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業集團);SpectraMAX Plus384酶標儀(美谷分子儀器有限公司);PIKORed 96實時熒光定量(RT-PCR)儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)。

1.3 骨髓間充質干細胞的分離和鑒定

取剩余10只大鼠,1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,75%乙醇全身浸泡消毒10 min,在無菌條件下分離股骨和脛骨,用添加青/鏈霉素的L-DMEM培養基沖出骨髓,然后制成單細胞懸液,1 000 r/min離心5 min后棄去上清液,重懸以1×109/L的細胞濃度接種于25 cm2培養瓶中,置37 ℃、CO2飽和濕度培養箱中培養,每3 d更換1次新鮮培養基,待細胞密度長至70%-80%融合時,用0.25%胰酶消化,1 ∶2的比例進行傳代培養,1% O2濃度條件低氧培養。培養后采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化及生長狀況并拍照。采用流式細胞儀檢測細胞表面標記(CD29、CD34、CD105、CD45)鑒定MSCs,具體步驟:收集培養后的細胞于1 000 r/min,4 ℃離心5 min,各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD105、CD45(稀釋度均1 ∶200),避光冰上孵育45 min,用500 μl PBS(含1%BSA)重懸細胞,流式細胞儀進行檢測分析。

1.4 膝關節骨性關節炎大鼠模型構建

除空白組外,其余三組均采用木瓜蛋白酶關節腔注射建立膝關節骨性關節炎大鼠模型[8]。用0.9%氯化鈉溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液,用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,然后雙膝關節備皮、消毒、屈曲約45°,從髕骨下緣前內側的膝眼向髁間窩方向進針,明顯有落空感后,針尖抵達股骨內側髁再回撤2 mm,并注射木瓜蛋白酶,分別向雙側膝關節腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 ml。每隔3 d注射1次,連續注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1周,觀察各組大鼠膝關節外觀,并在各組各取1只大鼠處死后,取關節軟骨行組織病理切片,驗證造模是否成功。

1.5 治療方法

造模成功后第2天,空白組和模型組大鼠膝關節腔注射生理鹽水0.3 ml,每周1次,共4次;甲氨蝶呤組大鼠腹腔注射0.5 mg/kg甲氨蝶呤,每周1次,共4次;骨髓間充質干細胞組大鼠膝關節腔內一次性注射骨髓間充質干細胞0.3 ml(細胞濃度為1×108/L),同時每周1次膝關節腔內注射生理鹽水0.3 ml,共4次。治療結束后,進行大鼠關節指數(AI)評分[9]:0分,無腫脹或紅斑;1分,輕度腫脹或紅斑;2分,中度腫脹;3分,重度腫脹;4分,關節僵硬或畸形,評分之和作為最終的AI評分。然后處死大鼠,采集軟骨和血清樣本進行進一步分析。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色觀察軟骨組織病理學變化 分離膝關節軟骨組織,經10%多聚甲醛固定,將固定的軟骨組織,經脫鈣、水合、透明、石蠟包埋后切片,切片厚度5 μm,采用HE染色,梯度酒精脫水,中性樹膠封固,鏡檢觀察膝關節軟骨組織病理學變化。

1.6.2 酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清RANKL、OPG、CXCL10含量 采用ELISA法檢測各組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量,根據ELISA試劑盒說明步驟嚴格操作。

1.6.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA表達 采用RNA提取試劑盒提取軟骨組織總RNA。將總RNA加入逆轉錄反應體系(10 μl),根據制造商說明書用特異性RT引物逆轉錄為cDNA。進行qRT-PCR分析,以β-actin作為內參,引物序列見表1。qRT-PCR反應條件:95 ℃初始變性10 min,隨后95 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,45個循環,記錄Ct值,采用2-ΔΔCt分析相對表達水平。

表1 RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3基因引物序列Table 1 Primer sequences of RANKL, OPG, TRAF6, CXCL10 and CXCR3 genes

1.6.4 蛋白印跡法(Western blot)檢測軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3蛋白表達 取軟骨組織,RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,樣品煮沸變性后于-20 ℃保存備用。使用等量蛋白質上樣,經10% SDS-PAGE分離后,置于聚偏氟乙烯膜上,在5%脫脂牛奶中封閉1 h后,與RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3(稀釋度均1 ∶500)一抗結合,于4 ℃孵育過夜,然后選擇合適的二抗在室溫孵育1 h,ECL暗室顯色。以β-actin表達作為內參,用Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶的光密度值,并用樣品光密度值與β-actin光密度值的比值進行分析。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞的鑒定

細胞形態觀察顯示細胞排列緊密,逐漸融合成片,且細胞形態均一,呈梭形生長,生長旺盛(見圖1)。流式細胞儀檢測結果顯示,培養后的BMSCs均表達CD29、CD34、CD45、CD105(見圖1)。表明BMSCs具有較強的分裂增殖能力。

圖1 骨髓間充質干細胞的鑒定Figure 1 Identification of bone marrow mesenchymal stem cells

2.2 骨髓間充質干細胞對KOA大鼠關節指數的影響

與空白組比較,模型組大鼠AI評分明顯升高(P<0.01);與模型組比較,甲氨蝶呤組和骨髓間充質干細胞組均能明顯降低大鼠AI評分(P<0.05,見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05圖2 各組大鼠AI評分比較Figure 2 Comparison of AI scores of rats in each group

2.3 骨髓間充質干細胞對KOA大鼠組織病理學的影響

空白組關節軟骨結構完整,未見明顯軟骨缺損、軟骨細胞壞死及纖維增生等病理改變。模型組關節軟骨侵蝕,軟骨面不平整,表層缺失,表面纖維組織增生和新生毛細血管形成,軟骨細胞數量顯著增多,軟骨細胞成簇,排列不規律,大量軟骨細胞壞死。甲氨蝶呤組關節軟骨侵蝕,軟骨面不平整,表層缺失,表面大量纖維組織增生,且見較多膠原纖維,軟骨細胞數量增多,排列紊亂,部分軟骨細胞壞死。骨髓間充質干細胞組關節軟骨損傷,軟骨面不平整,軟骨基質著色變淡,軟骨細胞數量顯著增多,排列紊亂,軟骨細胞成簇,較多新生軟骨細胞,嗜酸性增強(見圖3)。

圖3 骨髓間充質干細胞對KOA大鼠組織病理學的影響Figure 3 Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on histopathology of knee osteoarthritis rats

2.4 骨髓間充質干細胞對KOA大鼠RANKL、OPG和CXCL10水平的影響

與空白組比較,模型組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量均明顯增加(P<0.01);與模型組比較,甲氨蝶呤組OPG、CXCL10含量明顯降低,骨髓間充質干細胞組RANKL、OPG、CXCL10含量明顯降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠血清RANKL、OPG、CXCL10含量 (pg/ml)Table 2 Serum RANKL, OPG and CXCL10 levels of rats in each group (pg/ml)

2.5 骨髓間充質干細胞對KOA大鼠RANKL/OPG/TRAF6信號的影響

與空白組比較,模型組大鼠軟骨組織RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.01);與模型組比較,骨髓間充質干細胞組RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05,見圖4)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01圖4 各組大鼠軟骨組織RANKL/OPG/TRAF6相關因子表達Figure 4 Expression of RANKL/OPG/TRAF6 related factors in cartilage tissues of rats in each group

3 討論

KOA是一種導致疼痛、軟骨變形和關節炎癥的退行性關節疾病,其臨床特征為關節劇烈疼痛,也是導致殘疾的主要原因之一[10]。研究表明BMSCs有潛力作為再生細胞治療關節炎[11]。然而BMSCs治療KOA的具體機制尚仍有待進一步研究。甲氨蝶呤已被報道是關節炎的首選藥物,在關節炎中具有確切的治療療效,由此,本研究選用甲氨蝶呤作為陽性藥物對照,擬建立KOA動物模型,將BMSCs在缺氧條件下共培養,研究BMSCs預處理對KOA的治療作用并初步探討其機制。

近年來,研究顯示間充質干細胞在減緩骨關節炎中具有重要作用,間充質干細胞直接在關節內注射是臨床應用最簡單的方法[12]。在骨關節炎的山羊模型中注射自體BMSCs顯示骨關節炎內側半月板的明顯再生[13]。在膠原蛋白酶誘導的骨關節炎模型中早期注射自體脂肪衍生的間充質干細胞可以抑制滑膜增厚和軟骨破壞[14]。而自體MSCs單次關節內植入6個月可顯著緩解骨關節炎患者臨床相關疼痛[15]。此外,研究顯示關節內注射骨髓來源的間充質干細胞可獲得更好的臨床結果[16]。這些結果提示間充質干細胞具有減緩骨關節炎的作用。另研究發現,體內移植缺氧預處理的hBM-MSCs可促進無菌小鼠軟骨細胞的增殖并產生軟骨樣組織[17]。含1% O2的精氨酸-天冬氨酸-海藻酸鈉水凝膠中培養的細胞可促進成骨和血管生成反應,2%的O2可提高干細胞的增殖和成骨分化水平,提示低氧預處理是促進骨愈合的有效治療方法[18,19]。在免疫缺陷小鼠中,hBM-MSCs在1%的O2中預處理后植入到由羥基磷灰石和磷酸三鈣組成的支架上,可促進可溶性和不溶性膠原的合成,從而產生穩定的細胞外基質,進而促進骨再生[20]。在本研究中,我們發現KOA模型大鼠AI評分較空白組明顯升高,且關節軟骨侵蝕,軟骨細胞數量顯著增多,大量軟骨細胞壞死;甲氨蝶呤和BMSCs低氧預處理可明顯降低大鼠AI評分,且BMSCs低氧預處理可明顯改善KOA軟骨組織病理學變化,結果表明BMSCs低氧預處理對KOA軟骨組織病變具有延緩作用。

此外,骨重建受局部和全身破骨細胞分化和激活的刺激,由核因子κB激活劑受體(RANK)、核因子κB受體激活劑配體(RANKL)、骨保護素(OPG)組成的分子系統對于調節破骨細胞功能的不同特征至關重要,包括增殖、分化、融合、激活和凋亡[21]。RANKL被認為通過一系列的酶級聯反應啟動破骨細胞前體的唯一受體RANK,從而啟動破骨細胞的分化和活化[22]。OPG可充當RANKL的誘餌受體,通過與RANKL結合來抑制骨吸收,并阻止它與其受體RANKL相互作用[23]。研究表明大劑量的RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)培養的MSCs可以通過分泌OPG來抑制破骨細胞的分化和活性,RANKL可以改變MSCs的功能,從而抑制破骨細胞的形成[24]。然而,BMSCs低氧預處理對KOA大鼠破骨細胞功能的直接作用尚不確定,在本研究,我們發現BMSCs低氧預處理明顯抑制了模型大鼠RANKL、OPG、CXCL10含量。提示BMSCs低氧預處理可能抑制破骨細胞形成。TRAF6是一種重要的接頭分子,參與RANKL/RANK、TLR、IL-1βR等經典途徑的下游,是激活NF-κB途徑促進促炎細胞因子和破骨細胞相關因子釋放的關鍵因子[25]。此外,低氧可影響牙周韌帶細胞RANKL和OPG表達,是牙槽骨吸收的重要致病事件[26]。本研究進一步發現BMSCs低氧預處理可明顯降低KOA大鼠RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表達。提示BMSCs低氧預處理可能調控RANKL/OPG/TRAF6信號通路,在關節軟骨的維持中發揮重要作用。

綜上所述,骨髓間充質干細胞低氧預處理可能通過RANKL/OPG/TRAF6信號通路來減緩膝關節骨性關節炎的進展,進一步完善低氧預處理BMSCs的研究可能會促進BMSCs在骨關節炎潛在的臨床應用。