Chemerin/CMKLR1激活自噬促進ARPE-19細胞炎癥因子表達

劉 哲,王 旖,溫玉婷,袁 慧,朱夏茹,杜軍輝,*

(1西安市第九醫院交叉醫學研究室,西安 710054;2西安市第九醫院轉化醫學中心;3西安市第九醫院眼視光中心;*通訊作者,E-mail:djh79918@163.com)

趨化素(chemerin)是一種脂肪細胞因子,在許多疾病中發揮重要生理病理學作用。研究發現,多囊卵巢綜合征患者外周血chemerin水平明顯升高[1],在多種與糖尿病相關的疾病中表達水平異常,如妊娠期糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)等[2-5]。趨化因子樣受體1(chemokine-like receptor 1,CMKLR1)是chemerin的受體,兩者結合可以產生一系列生物學效應。我們前期研究發現,DR患者血清chemerin表達水平升高[5],提示chemerin可能參與了DR的進展。視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells, RPE)在許多眼底疾病中發揮重要作用,其病理改變參與眼底病變的發生及發展。近年來,研究表明,自噬與炎癥在DR進展中發揮重要作用[6-10]。在以往研究中發現白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與DR密切相關,參與病變的進展[11-13]。在動物模型中發現IL-1β在糖尿病大鼠血清和視網膜中表達升高[11,12],TNF-α在DR患者血清中表達水平升高,是DR發生發展的獨立危險因素[13],與DR病情嚴重程度有關[14]。關于Chemerin/CMKLR1對RPE細胞IL-1β、TNF-α表達及自噬的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討Chemerin/CMKLR1對RPE表達細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人視網膜色素上皮細胞系(ARPE-19細胞)購自中國科學院上海細胞生物研究所,重組人脂肪因子chemerin購于美國PeproTech公司,LC3、Beclin-1購于美國CST公司,IL-1β、TNF-α購于美國CST公司,α-NETA購于美國MCE公司,其他細胞培養耗材、試劑購自碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養與分組

按細胞培養說明書培養ARPE-19細胞株,ARPE-19細胞采用RPMI-1640培養液,其中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素,于37 ℃、5% CO2加濕培養箱中培養。當細胞數量為80%-90%時,胰蛋白酶消化ARPE-19細胞,1 600 r/min離心5 min,收集、重懸并培養細胞。將ARPE-19細胞分為7組檢測細胞增殖情況,分別是:空白對照組、1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組、1 nmol/L chemerin+α-NETA組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組、100 nmol/L chemerin+α-NETA組。空白對照組ARPE-19細胞用RPMI-1640培養液中培養48 h。1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組分別使用終濃度為1,10,100 nmol/L chemerin處理ARPE-19細胞20 min,換液加入RPMI-1640培養液中培養48 h。1 nmol/L chemerin+α-NETA組、10 nmol/Lm chemerin+α-NETA組、100 nmol/Lm chemerin+α-NETA組分別使用終濃度為1,10,100 nmol/L chemerin處理ARPE-19細胞20 min,換液加入1.25 μmol/Lα-NETA處理48 h。

將細胞隨機分為5組檢測細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1,分別是:空白對照組、1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組。將細胞分為3組檢測細胞遷移和IL-1β、TNF-α蛋白表達水平,分別是:空白對照組、10 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組。根據不同分組處理細胞后,培養48 h后進行相關檢測。

1.3 CCK8法檢測ARPE-19細胞增殖

取對數生長期ARPE-19細胞,調整細胞密度為5×104/ml,96孔板每孔接入100 μl細胞懸液,37 ℃培養過夜,根據1.2所述細胞分組情況將細胞隨機分為7組,分別使用不同濃度chemerin及α-NETA處理ARPE-19細胞,換液加入RPMI-1640培養液中培養48 h,每組3個復孔,37 ℃培養24 h后,每孔加入10 μl CCK8,37 ℃培養4 h;酶標儀測定各孔吸光值OD 450。

1.4 Western blotting檢測自噬相關蛋白LC3、Beclin-1蛋白表達

根據1.2所述細胞分組處理細胞后,分別收集各組ARPE-19細胞,裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h;將蛋白轉移到PVDF膜上,隨后進行免疫印跡顯色,用封閉液稀釋相應的一抗,GAPDH(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶2 000)、Beclin-1(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。漂洗后加入用HRP標記的二抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。晾干膠片,掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.5 Transwell檢測ARPE-19細胞遷移

取ARPE-19細胞,0.25%胰酶消化收集,用無血清培養基稀釋ARPE-19細胞濃度至1×105/ml,備用;在24孔板中預先加入800 μl含10%FBS的培養基(含雙抗),并放入Transwell小室,1 h后在Transwell上室分別接入細胞懸液200 μl(根據1.2所述細胞分組情況進行分3組處理),37 ℃,5% CO2培養箱培養24 h;取出Transwell,用PBS清洗后加入10%甲醇溶液固定ARPE-19細胞30 min;小心切下膜,在膜上滴50 μl 5%結晶紫染液,室溫中放置20 min,PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Western blotting檢測IL-1β、TNF-α蛋白表達

根據1.2所述細胞分組情況收集各組ARPE-19細胞,裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h;將蛋白轉移到PVDF膜上,隨后進行免疫印跡顯色,用封閉液稀釋相應的一抗,GAPDH(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。漂洗后加入用HRP標記的二抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。晾干膠片,掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.7 統計學分析

通過SPSS19.0軟件進行結果整理,數據用均數±標準差表示,多組間均數的比較用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法,以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞增殖的影響

使用CCK8法檢測了不同處理組ARPE-19細胞的增殖情況,在細胞培養24 h后,結果表明:與空白對照組相比,1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組細胞的增殖活性增強(P<0.05);與1 nmol/L chemerin組相比,1 nmol/L chemerin+α-NETA組細胞的增殖受到抑制(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組細胞的增殖受到抑制(P<0.05);與100 nmol/L chemerin組相比,100 nmol/L chemerinα-NETA組細胞的增殖受到抑制(P<0.05,見圖1)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與各自對相應濃度組比較,#P<0.05圖1 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞增殖的影響Figure 1 Effect of Chemerin/CMKLR1 on the proliferation of ARPE-19 cells

2.2 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞LC3、Beclin-1蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示:與空白對照組相比,1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組LC3、Beclin-1蛋白表達水平升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerinα-NETA組LC3、Beclin-1蛋白表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

2.3 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞遷移的影響

Transwell檢測ARPE-19細胞遷移結果顯示:空白對照組、10 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組細胞遷移數分別是50.8±8.1,67.8±6.9,41.6±6.3。與空白對照組相比,10 nmol/L chemerin組細胞遷移數增加,差異具有統計學意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組細胞遷移數減少,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖2 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞LC3、Beclin-1的影響Figure 2 Effects of Chemerin/CMKLR1 on LC3 and Beclin-1 in ARPE-19 cells

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖3 Chemerin/CMKLR1對細胞遷移的影響 (×200)Figure 3 Effect of Chemerin/CMKLR1 on cell migration (×200)

2.4 Western blotting檢測Chemerin/CMKLR1對炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示:與空白對照組相比,10 nmol/L chemerin組IL-1β和TNF-α蛋白表達水平升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組IL-1β和TNF-α蛋白表達水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖4 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細胞IL-1β、TNF-α的影響Figure 4 Effects of Chemerin/CMKLR1 on IL-1β and TNF-α in ARPE-19 cells

3 討論

RPE細胞是視網膜中發揮重要生理作用的一種細胞,能夠表達多種細胞因子,如:炎癥因子、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,RPE細胞受損參與很多眼底疾病的發展,包括年齡相關性黃斑變性、視網膜色素變性、DR等。本研究結果表明,Chemerin/CMKLR1能夠促進RPE細胞表達炎癥因子IL-1β、TNF-α,可能通過促進炎癥反應而促進DR的進展。以往研究表明[15],DR患者體內存在炎癥反應,這是導致DR進展的一個重要因素。CMKLR1是chemerin的功能性受體,在許多組織中均有表達,主要表達于脂肪組織和肺,血管內皮細胞也存在CMKLR1受體,我們的研究證實了RPE細胞也能夠表達CMKLR1受體。以往研究發現,IL-1β、TNF-α與DR密切相關,參與病變的進展[16,17]。在動物模型中發現IL-1β在糖尿病大鼠血清和視網膜中表達升高[11,12],在增殖性DR組織中呈高表達,能夠通過上調炎性因子與氧化因子表達水平等多種途徑促進DR進展[16,18]。TNF-α在糖尿病大鼠視網膜中也呈現高表達[19],在DR患者血清中,TNF-α表達水平同樣升高,是DR發生發展的獨立危險因素[13],與DR病情嚴重程度有關[14]。IL-1β、TNF-α能夠通過促進炎癥反應,進而促進DR的進展。我們的研究結果證實了Chemerin/CMKLR1可能通過上調炎癥因子IL-1β、TNF-α表達促進DR進展。

視網膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)形成是增生性DR的主要病理改變。近年來發現自噬在新生血管形成中發揮重要作用[20-22]。我們研究結果表明,Chemerin/CMKLR1能夠促進自噬相關蛋白LC3、Beclin-1的表達,表明Chemerin/CMKLR1能夠啟動RPE細胞自噬的激活。這與其他研究結果一致[23],以往研究還表明,自噬的激活能夠促進RPE細胞表達及分泌VEGF,進而促進新生血管的形成[24]。結合上述研究結果表明Chemerin/CMKLR1可能通過激活自噬,進而促進VEGF表達,促進視網膜血管內皮細胞的增殖、分裂、遷移,最終促進新生血管形成,進而參與增生性DR的病理進展。此外,Chemerin及其受體CMKLR1可能通過多條途徑激活自噬有,比如:通過上調ROS表達激活自噬,通過促進炎癥反應激活自噬等[23]。我們的研究表明Chemerin/CMKLR1能夠促進RPE細胞增殖和遷移。而RPE細胞增殖和遷移在增生性DR的發展中起到重要作用,能夠促進眼底增殖膜的形成。因此,這也是Chemerin/CMKLR1促進增生性DR進展的重要因素。

綜上所述,chemerin/CMKLR1能夠激活RPE細胞自噬、促進細胞增殖和遷移、促進炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達,進而參與并促進DR的進展。本研究主要研究了自噬起始階段的自噬相關蛋白表達情況,未對自噬流、自噬溶酶體功能進行檢測,這是研究的不足之處。我們計劃下一步對此進行研究,并在動物模型體內對細胞研究結果進行驗證。