岫巖遼五味子的質量評價

韓 毅,于 艷,龔 偉,魏新智,鞠業濤

(遼寧中醫藥大學附屬醫院實驗中心,沈陽 110032;*通訊作者,E-mail:95142012@qq.com)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實,商品分為北五味和南五味(西五味),遼寧所產習稱北五味,素有“遼五味”之稱,為遼寧的道地藥材。《本草綱目》記載:“遼東域之五味,油足性澀,乃為上品!異地均次之。”現代醫藥也把遼五味子列為上品,遼寧鞍山岫巖建有遼五味的種植基地,為遼五味的主要產地。中藥材特別是高品質道地藥材長期以來一直受到國內外醫藥、保健以及食品等行業的普遍關注,五味子是一種多功能、多用途的藥食兼用型經濟植物,是藥材市場重點關注的品種之一。五味子市場需求量逐年增加,不但國內大量需求,還出口到韓國、日本、新加坡等東南亞國家,所以對五味子的質量評價研究具有重要意義。

本試驗選取遼寧鞍山岫巖種植基地生長的不同年限,不同采收時間的10批藥材,參照2020年版《中國藥典》及有關文獻對岫巖遼五味子進行顯微鑒別[1]和薄層鑒別,對雜質、水分、總灰分進行含量測定[2]。五味子化學成分研究表明,其成分為木脂素類、多糖、有機酸、揮發油、黃酮等[3],其主要成分為木質素類[4,5],含量最高,2020年版《中國藥典》中以五味子醇甲作為五味子含量的檢測依據,本實驗除檢測五味子醇甲外,還對五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素3種指標性成分進行檢測[6],建立了岫巖遼五味子的藥材質量評價標準。目前關于五味子多指標成分含量測定的研究較多[7],對特定地域所產的五味子進行系統研究的較少,本研究建立岫巖遼五味子更全面的內在質量控制指標,對保證藥材質量及臨床合理應用具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

美國Agilent1100高效液相色譜儀,G1379A真空脫氣機,G1311A四元梯度泵,G1313A自動進樣器,G1315柱恒溫箱,G1315B二極管陣列檢測器;Agilent B 04 03色譜工作站,CL-L生物顯微鏡,BL-420N生物信號采集處理系統,ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),FX-400S型數控超聲波清洗機(濟寧豐鑫超聲設備有限公司)。

1.2 試藥及試劑

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對照品購自中國食品藥品檢定研究院,批號分別為110857-201010,110764-201111,110765-201512。五味子醇乙對照品購自上海源葉生物科技有限公司,批號為20120705。五味子對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院,批號為120922-201610。乙腈為色譜純(美國Fisher公司),水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司),其余試劑均為分析純。中藥材均采自遼寧鞍山岫巖縣五味子種植基地,經遼寧中醫藥大學藥學院鑒定教研室李峰教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 原植物形態描述

落葉木質藤本,長可達8 m,小枝褐色。單葉互生,葉卵形、寬倒卵形至寬橢圓形,長5-7 cm,邊緣疏生有腺體的細齒,上面有光澤,無毛(見圖1)。花單性,雌雄異株;單生或簇生葉腋,花被片粉白色或粉紅色,6-9片,乳白色或粉紅色;雄花具5雄蕊,花絲合生成短柱;雌花心皮17-40,花后花托逐漸伸長,果熟時呈穗狀聚合果。漿果球形,肉質,熟時深紅色(見圖1)。花期5-7月,果期6-9月。

圖1 岫巖遼五味子原植物及果實圖Figure 1 Graph of original plant and fruit of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.2 鑒別

2.2.1 藥材形狀鑒別 本品呈不規則的球形或扁球形,直徑5-8 mm。表面紅色、紫紅色或暗紅色,皺縮,顯油潤;有的表面呈黑紅色或出現“白霜”。果肉柔軟,種子1-2粒,腎形,表面棕黃色,有光澤,種皮薄而脆。果肉氣微,味酸(見圖2)。

圖2 岫巖遼五味子藥材Figure 2 Photograph of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.2.2 顯微鑒別 岫巖遼五味子粉末顯微特征:粉末暗紫色,種皮表皮石細胞表面觀呈多角形或長多角形,大小頗均勻,直徑18-50 μm,長至55-90 μm,壁厚6-25 μm,紋孔圓點狀或不明顯,壁厚,孔溝極細密,胞腔明顯,內含棕色或棕黑色物(見圖3A)。種皮內層石細胞,形體較大,常緊附于種皮表皮石細胞層,或單個散離,多破碎。呈類多角形、類圓形、卵圓形、長橢圓形或不規則形,直徑25-83 μm,長65-140 μm,壁厚13-38 μm,紋孔密而較大,呈點狀、短縫狀或叉狀,孔溝稍粗,胞腔明顯(見圖3B)。果皮表皮細胞表面觀類多角形,垂周壁略呈連珠狀增厚,表面有角質線紋;表皮中散有油細胞(見圖3C)。油細胞散在于表皮中,呈類圓形或圓多角形,直徑約39-135 μm,壁稍厚,內含揮發油滴(見圖3D)。中果皮細胞皺縮,界限不明顯,含暗棕色物,并含淀粉粒(見圖3E)。導管螺紋,偶有網紋(見圖3F)。內胚乳細胞呈類多角形,壁稍厚,內含脂肪油滴(見圖3G)。

圖3 岫巖遼五味子粉末顯微特征Figure 3 Microscopic characteristics of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan powder

2.2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末1 g,加三氯甲烷20 ml,加熱回流30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取五味子對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。分別取五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲對照品適量,精密稱定,加三氯甲烷制成每1 ml分別含五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲各1 mg的混合對照品溶液。照薄層色譜法(2020年版《中國藥典》四部通則0502)試驗,吸取供試品溶液、對照藥材溶液各6 μl,對照品溶液2 μl,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以石油醚(30-60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15 ∶5 ∶1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點(見圖4)。

S.標準對照條帶;1.五味子對照藥材溶液;2-11.10批次供試品溶液圖4 岫巖遼五味子薄層色譜圖Figure 4 Thin layer chromatogram of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.3 雜質、水分、總灰分的測定

參照2020年版《中國藥典》四部通則2301雜質測定法測定,測得10批樣品中雜質的量為0.4%-0.7%(見表1)。

參照2020年版《中國藥典》四部通則0832水分測定法第二法測定水分,測得10批藥材水分的含量為7.6%-14.7%(見表1)。

參照2020年版《中國藥典》四部通則2302灰分測定法總灰分測定法測定,測得10批樣品中總灰分的含量為2.8%-5.8%(見表1)。

表1 岫巖遼五味子中雜質、水分、總灰分含量測定結果Table 1 Determination results of impurity, water and total ash contents in Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.4 木脂素含量測定

2.4.1 色譜條件及適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈為流動相A,水為流動相B,按表2中的規定進行梯度洗脫;檢測波長為250 nm。理論塔板數按五味子醇甲峰計算應不低于2 000,分離度大于1.5。在上述色譜條件下,各組分分離度較好,各峰之間互不干擾。木脂素對照品及岫巖遼五味子樣品色譜圖見圖5。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素圖5 對照品與岫巖遼五味子樣品的HPLC圖Figure 5 High performance liquid chromatogram of reference substance and Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品,加甲醇制成每1 ml分別含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素各0.1 mg的溶液,搖勻,即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.3 g(過三號篩),精密稱定,置25 ml量瓶中,加甲醇約20 ml,超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)30 min,取出,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4.4 提取條件考察

2.4.4.1 提取溶劑的考察 根據五味子醇甲等成分的化學性質及查閱文獻,本試驗選用甲醇、乙醇、80%甲醇、三氯甲烷4種提取溶劑,采用超聲處理30 min的提取方式,再按上述色譜條件測定,考察4種木脂素成分的提取效率,結果見表3。

表3 提取溶劑的考察結果 (mg/g)Table 3 Effect of extraction solvent on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.4.2 提取方法的考察 以甲醇為提取溶劑,采用超聲提取和加熱回流提取兩種方法,考察4種木脂素成分的提取效率,結果見表4。

表4 提取方法的考察結果 (mg/g)Table 4 Effect of extraction method on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.4.3 提取時間的考察 以甲醇為提取溶劑,采用超聲處理的方法提取不同的時間,考察4種木脂素成分的提取效率,結果見表5。

表5 超聲提取時間的考察結果 (mg/g)Table 5 Effect of ultrasonic extraction time on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.5 方法學驗證試驗

2.4.5.1 線性范圍考察 分別精密吸取混合對照品儲備液(含五味子醇甲0.110 8 mg/ml、五味子醇乙0.072 30 mg/ml、五味子甲素0.106 5 mg/ml、五味子乙素0.106 0 mg/ml)0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 ml,置5 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。分別精密吸取混合對照品儲備液及各稀釋液各20 μl,注入液相色譜儀中,記錄色譜峰面積。進樣量X(μg)與色譜峰面積Y經線性回歸,得回歸方程為:五味子醇甲Y=2 039X+23.44,r=0.999 9;五味子醇乙Y=1 616X+14.51,r=0.999 9;五味子甲素Y=1 963X+25.07,r=0.999 9;五味子乙素Y=1 696X+19.80,r=0.999 9。五味子醇甲在0.110 8-2.216 μg,五味子醇乙在0.072 30-1.445 μg,五味子甲素在0.106 5-2.130 μg,五味子乙素在0.106 0-2.120 μg范圍內線性關系良好。

2.4.5.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液5 μl,連續進樣6次,結果峰面積值的RSD分別為五味子醇甲0.4%,五味子醇乙0.5%,五味子甲素0.5%,五味子乙素0.5%,表明本方法精密度較好。

2.4.5.3 重復性試驗 取本品6份,按“供試品溶液的制備”項下分別制備成供試品溶液,按樣品含量測定方法測定,結果平均含量分別為五味子醇甲6.830 mg/g、五味子醇乙1.580 mg/g、五味子甲素1.710 mg/g、五味子乙素2.890 mg/g,RSD分別1.9%,2.0%,2.7%,2.2%,表明本方法重復性良好。

2.4.5.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液,分別在0,2,4,6,8,10,12,14 h測定峰面積,結果峰面積RSD分別為五味子醇甲1.3%、五味子醇乙1.3%,五味子甲素1.3%,五味子乙素1.3%,表明本品溶液14 h內穩定性良好。

2.4.5.5 加樣回收率試驗 分別稱取6份已知含量的供試品0.15 g,精密稱定,置25 ml量瓶中,分別精密加入混合對照品溶液(含五味子醇甲0.917 0 mg/ml、五味子醇乙0.217 0 mg/ml、五味子甲素0.310 0 mg/ml、五味子乙素0.313 0 mg/ml)1.0 ml,按供試品溶液制備方法制備,進行含量測定,計算回收率,結果見表6。

表6 加樣回收率試驗結果 (n=6)Table 6 Sample recovery test results (n=6)

2.4.6 樣品含量測定 取本品粉末(過三號篩,產地均為岫巖遼五味子生產基地),按上述方法制備成供試品溶液,再按選定的色譜條件測定峰面積,用外標法計算樣品中4種木脂素類成分的含量,結果見表7。

表7 樣品中4種木脂素類成分的含量測定結果Table 7 The contents of four lignans in the samples

根據以上測定結果,暫定本品含量按干燥品計含五味子醇甲(C24H32O7)不少于0.4%,五味子醇乙(C23H28O7)、五味子甲素(C22H28O6)和五味子乙素(C23H28O6)的總量不少于0.4%。

3 討論

3.1 岫巖遼五味子薄層色譜研究

供試品點樣量選擇了2,4,6 μl,結果發現點樣量在6 μl時,斑點比較清晰。展開距離選擇了4,6,8 cm,結果發現展距在4 cm時,各組分分離度好,展距在8 cm時,斑點出現變形現象,故選擇展距為4 cm,效果最佳。

3.2 岫巖遼五味子中木脂素提取方法選擇

根據五味子醇甲等成分的化學性質及查閱文獻[8],本試驗分別選用甲醇、乙醇、80%甲醇、三氯甲烷4種溶劑,采用超聲、加熱回流、提取時間考察4種木脂素成分的提取效率,結果發現采用甲醇提取效果最佳。以甲醇為提取溶劑,采用超聲和加熱回流兩種提取方法,結果發現超聲提取效果最好。以甲醇為提取溶劑,采用超聲處理方法,考察超聲提取時間,結果發現超聲提取30 min與超聲提取60 min提取效率相差不多,為節省能源,故選擇超聲提取30 min。

岫巖遼五味子為遼寧高品質道地中藥材規模化種植及精準扶貧示范研究品種之一,本實驗依據2020年版《中國藥典》五味子項下對雜質、水分、總灰分的含量進行檢測。采用顯微鑒別法、TLC鑒別法對樣品進行鑒定,采用HPLC測定樣品中4種木脂類指標性成分的含量[9,10],對岫巖遼五味子進行了初步研究,建立了內在質量控制指標。在此基礎上,逐步建立藥材的采收、加工、倉儲、HPLC指紋圖譜等一系列深化研究[11],揭示道地藥材內在質量的優越性,建立更全面的質量控制指標,為北五味等道地藥材的規模化種植提供技術保障。